Zavedenie metódy pre izoláciu exozómov z ľudskej krvi

Abstract

Táto diplomová práca je zameraná na zavedenie systému izolácie exozómov, pomocou ktorej by bolo možné detegovať tieto EVs z ľudskej krvi. Tento Systém je založený na kombinácii imunoanalýzy magnetickej separácie na báze imunoprecipitácie a imunochemickej detekcie vyizolovaných exozómov komerčným izolačným kitom. Princíp separácie spočíva v reakcii antigénu v podobe povrchových proteínov na exozómoch so špecifickými monoklonálnými a polyklonálnymi protilátkami imobilizovanými na komerčných magnetických časticiach namierených proti týmto exozomálnym proteínom. Prítomnosť exozómov vo vzorkách séra je detegovaná metódou Semi-Dry Western blot pomocou sekundárnych protilátok značených chrenovou peroxidázou (HRP) pre chemiluminiscenčnú detekciu po predchádzajúcom rozdelení proteínov SDS-PAGE analýzou. Konečným overením prítomnosti exozómov vo vyizolovanej frakcii je hmotnostná analýza po proteolytickom naštepení proteínov z gélu modifikovaným trypsínom.