Optimalizace podmínek vazby kináz GSK-3 a MAPK na superparamagnetické částice

Abstract

V diplomové práce byly provedeny optimalizace podmínek fosforylace substrátu CREB fosfopeptidu (cAMP Response Element Binding Protein) enzymem GSK-3 a substrátu TH 24 - 33 (Tyrosine hydroxylase 24 - 33) enzymem MAPK- His tag a optimalizace podmínek imobilizace obou enzymů na superparamagnetické částice. Mezi sledované parametry patřily teplota a délka fosforylace. GSK-3 byla imobilizována na magnetické nosiče SiMAG-IDA/Nickel, SiMAG-PGL, SiMAG-IDA/Co3+ a BcMAG Aldehyde magnetické částice. MAPK- His tag byla úspěšně imobilizována na SiMAG-IDA/Co3+ a BcMAG Aldehyde magnetické částice. U všech nosičů pro GSK-3 byla sledována skladovací stabilita, u některých případně operační stabilita. Nejstabilnější byla imobilizace GSK-3 na SiMAG-IDA/Co3+ sledovaná po jednom týdnu. GSK-3 i MAPK-His tag byly pouţity pro přípravu tzv. hyperfosforylovaného tau proteinu, jako standardu. Tau protein byl štěpen imobilizovaným trypsinem. Fosforylace peptidových substrátů byly potvrzeny pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie. Následnou analýzou MALDI TOF/TOF se potvrdila fosforylace u tau peptidu 45 - 67 s Mr 2471 Da.