Využití moderních analytických metod při studiu enzymové toxicity látek

Abstract

Acetaminofen patří v současné době mezi nejvíce používaná analgetika a antipyretika. Po předávkování však dochází k řadě patologických reakcí, které mohou vést až k akutnímu selhání jater nebo ledvin. Přesný mechanismus jeho toxicity není dosud zcela znám. Po předávkování je acetaminofen přednostně oxidován cytochromy P450 na vysoce reaktivní meziprodukt, který dále reaguje s intracelulárním glutathionem za vzniku konjugátu APAP-SG. Tento konjugát byl dosud považován za produkt detoxikační. Cílem této práce bylo ověřit možnou toxicitu konjugátu APAP-SG, protože během našich předběžných pokusů jsme zjistili, že tento konjugát může pravděpodobně působit toxicky. Hlavním cílem bylo otestovat jeho případný vliv na aktivitu lidské purifikované a rekombinantní glutathionreduktázy, jakožto velmi důležitého antioxidačního enzymu a také na produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) v izolovaných mitochondriích. Konjugát APAP-SG byl syntetizován de novo organickou syntézou a purifikován pomocí preparativní chromatografie. Pro testování enzymové inhibice jsme glutathionreduktázu purifikovali z lidských erytrocytů pomocí bioafinitní chromatografie. Mitochondrie jsme izolovali z potkaních jater a z linie buněk proximálních tubulů. V souladu s naší hypotézou jsme potvrdili, že APAP-SG inhibuje glutathionreduktázu v závislosti na dávce. Tuto inhibici jsme potvrdili u obou testovaných enzymů. APAP-SG působil jako kompetitivní inhibitor s hodnotou inhibiční konstanty 4,8 ? 1,7 mmol/l (pro rekombinantní enzym) a 5,4 ? 0,3 mmol/l (pro purifikovaný enzym). U izolovaných mitochondrií inkubovaných s APAP-SG jsme prokázali zvýšenou produkci ROS jak v, tak bez přítomnosti substrátů pro mitochondriální komplexy I a II. Pro určení přesné lokalizace produkce ROS jsme dále testovali kombinace jednotlivých substrátů a inhibitorů pro jednotlivé komplexy respiračního řetězce. K produkci ROS překvapivě došlo ve všech experimentech a také v případě, kdy byl k mitochondriím přidán samotný konjugát APAP-SG. Tyto výsledky potvrdily naší hypotézu, že produkt acetaminofenu, dosud považovaný za ?detoxikační?, způsobuje řadu toxických dějů, které mohou velmi pravděpodobně přispívat k celkové acetaminofenové toxicitě.