Využití moderních analytických metod při studiu enzymové toxicity látek

Roušarová, Erika

Publikace:
Využití moderních analytických metod při studiu enzymové toxicity látek

Disertační práceOmezený přístup

dc.contributor.advisor	Ventura, Karel
dc.contributor.author	Roušarová, Erika
dc.contributor.referee	Fryčák, Petr
dc.contributor.referee	Večeřa, Rostislav
dc.contributor.referee	Vrbacký, Aleš
dc.date.accepted	2015-10-26
dc.date.accessioned	2016-04-25T16:10:14Z
dc.date.available	2016-04-25T16:10:14Z
dc.date.issued	2015
dc.date.submitted	2015-10-02
dc.description.abstract	Acetaminofen patří v současné době mezi nejvíce používaná analgetika a antipyretika. Po předávkování však dochází k řadě patologických reakcí, které mohou vést až k akutnímu selhání jater nebo ledvin. Přesný mechanismus jeho toxicity není dosud zcela znám. Po předávkování je acetaminofen přednostně oxidován cytochromy P450 na vysoce reaktivní meziprodukt, který dále reaguje s intracelulárním glutathionem za vzniku konjugátu APAP-SG. Tento konjugát byl dosud považován za produkt detoxikační. Cílem této práce bylo ověřit možnou toxicitu konjugátu APAP-SG, protože během našich předběžných pokusů jsme zjistili, že tento konjugát může pravděpodobně působit toxicky. Hlavním cílem bylo otestovat jeho případný vliv na aktivitu lidské purifikované a rekombinantní glutathionreduktázy, jakožto velmi důležitého antioxidačního enzymu a také na produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) v izolovaných mitochondriích. Konjugát APAP-SG byl syntetizován de novo organickou syntézou a purifikován pomocí preparativní chromatografie. Pro testování enzymové inhibice jsme glutathionreduktázu purifikovali z lidských erytrocytů pomocí bioafinitní chromatografie. Mitochondrie jsme izolovali z potkaních jater a z linie buněk proximálních tubulů. V souladu s naší hypotézou jsme potvrdili, že APAP-SG inhibuje glutathionreduktázu v závislosti na dávce. Tuto inhibici jsme potvrdili u obou testovaných enzymů. APAP-SG působil jako kompetitivní inhibitor s hodnotou inhibiční konstanty 4,8 ? 1,7 mmol/l (pro rekombinantní enzym) a 5,4 ? 0,3 mmol/l (pro purifikovaný enzym). U izolovaných mitochondrií inkubovaných s APAP-SG jsme prokázali zvýšenou produkci ROS jak v, tak bez přítomnosti substrátů pro mitochondriální komplexy I a II. Pro určení přesné lokalizace produkce ROS jsme dále testovali kombinace jednotlivých substrátů a inhibitorů pro jednotlivé komplexy respiračního řetězce. K produkci ROS překvapivě došlo ve všech experimentech a také v případě, kdy byl k mitochondriím přidán samotný konjugát APAP-SG. Tyto výsledky potvrdily naší hypotézu, že produkt acetaminofenu, dosud považovaný za ?detoxikační?, způsobuje řadu toxických dějů, které mohou velmi pravděpodobně přispívat k celkové acetaminofenové toxicitě.	cze
dc.description.abstract-translated	At present, acetaminophen belongs to the most commonly used analgesics and antipyretics. After overdose, acetaminophen can cause a number of pathological processes that could even lead to liver or kidney failure. However, the entire mechanism of toxicity remains unknown. After overdose, acetaminophen is predominantly oxidized by cytochromes P450 to a highly reactive intermediate that reacts with glutathione generating APAP-SG conjugate. This conjugate has been recognized as a detoxification product. The aim of present PhD thesis was to confirm the possibility of APAP-SG toxicity because, based on our preliminary experiments, we found that this conjugate might possess toxicity. The mail goal was to characterize its possible inhibitory effect on human glutathione reductase (purified and recombinant) that is a very important antioxidant enzyme. We also estimated reactive oxygen species (ROS) production in isolated mitochondria. The APAP-SG conjugate was synthesized using organic synthesis de novo and purified using preparative liquid chromatography. We used bioaffinity chromatography for purification of glutathione reductase from human red blood cells. Consequently, enzyme inhibition was estimated in this enzyme. We isolated mitochondria from rat liver and from proximal tubular cell line. In accordance to our hypothesis, we proved that APAP-SG is able to inhibit glutathione reductase dose dependently. The inhibitory effect was found in both tested enzymes. APAP-SG was found to be a competitive inhibitor with inhibition constant of 4.8 ? 1.7 mmol/l (for recombinant enzyme) and 5.4 ? 0.3 mmol/l (for purified enzyme). We proved that isolated mitochondria incubated with APAP-SG produced significantly higher levels of ROS in/without presence of substrates for mitochondrial complexes I and II. For determination of ROS production localization, we also estimated combinations of substrates and respiratory chain inhibitors. Surprisingly, ROS production was proved in all experiments, i.e. also in presence of APAP-SG alone. These results confirmed our hypothesis that an acetaminophen metabolism product considered as detoxification molecule can cause a number of toxic processes that may contribute to the entire acetaminophen toxicity.	eng
dc.description.department	Fakulta chemicko-technologická	cze
dc.description.grade	Dokončená práce s úspěšnou obhajobou	cze
dc.format	164 s.	cze
dc.format.extent	2391264 bytes
dc.format.mimetype	application/octet-stream
dc.identifier	Univerzitní knihovna (studovna)	cze
dc.identifier.signature	D33728
dc.identifier.stag	29302
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/10195/64089
dc.language.iso	cze
dc.publisher	Univerzita Pardubice	cze
dc.rights	Práce není přístupná
dc.subject	glutathionreduktáza	cze
dc.subject	glutathione reductase	eng
dc.subject	paracetamol	cze
dc.subject	oxidační stres	cze
dc.subject	mitochondrie	cze
dc.subject	ROS	cze
dc.subject	paracetamol	cze
dc.subject	oxidační stres	cze
dc.subject	mitochondrie	cze
dc.subject	ROS	cze
dc.subject	oxidative stress	eng
dc.subject	mitochondria	eng
dc.thesis.degree-discipline	Analytická chemie	cze
dc.thesis.degree-grantor	Univerzita Pardubice. Fakulta chemicko-technologická	cze
dc.thesis.degree-name	Ph.D.
dc.thesis.degree-program	Analytická chemie	cze
dc.title	Využití moderních analytických metod při studiu enzymové toxicity látek	cze
dc.title.alternative	Estimation of enzyme toxicity using modern analytical methods	eng
dc.type	disertační práce	cze
dspace.entity.type	Publication