Fluorescenční metody pro detekci buněčného poškození

Abstract

Fluorescenční metody jsou specifické, citlivé a selektivní. Často jsou pro tyto vlastnosti využívány v přírodních vědách pro detekci různých buněčných parametrů. Pomocí fluorescenčních sond jsme schopni detekovat intracelulární koncentrace analytů, potenciály na membránách buněk i organel či vizualizovat buněčné organely. Cílem naší práce bylo optimalizovat spektrofluorimetrickou metodu pro rutinní detekci koncentrace glutathionu (GSH) v buňkách. Dále pak optimalizovat spektrofluorimetrickou metodu pro detekci fragmentované DNA a využít tyto, i další fluorescenční metody pro charakterizaci toxického působení CdCl2. Při detekci intracelulárních koncentrací GSH jsme využili fluorescenční sondu monochlorobiman. Při vyhodnocení získaného fluorescenčního signálu v čase jsme optimalizovali analýzu detekovaného signálu. Koncentrace glutathionu vypočtené pomocí nově vypracované metodiky jsme následně porovnali jak se standardně používaným zpracováním naměřených dat, tak i s koncentracemi GSH naměřenou pomocí referenční metody využívající o-ftalaldehyd. Kromě shodných výsledků naměřených optimalizovanou i referenční metodou jsme prokázali také velmi silnou korelaci obou metod při analýze biologických vzorků (r = 0,96). Pro spektrofluorimetrickou detekci fragmentovane DNA jsme využili sondu Hoechst 33258, pomocí které jsme detekovali signifikantní vliv vybraných modelových toxinů na proces fragmentace DNA. Nejvyšší narůst fluorescence Hoechst 33258 jsme detekovali u buněk ovlivněnych 50 a 100 ěM cisplatinou po 24 hod inkubaci. Nasledně jsme v posledni části práce detekovali změny koncentrace GSH, fragmentaci DNA, mitochondriální membránový potenciál a produkci ROS u buněk inkubovaných s CdCl2.