Imobilizace Clostripainu na magnetické nosiče a jeho využití pro fragmentaci Tau proteinu

Abstract

Diplomová práce byla zaměřena na zavedení metody stanovení aktivity proteolytického enzymu Clostripainu, optimalizaci reakčních podmínek, imobilizaci na vhodný magnetický nosič a jeho následné použití pro fragmentaci tau proteinu. Aktivita Clostripainu byla měřena pomocí chromogenního substrátu BApNA (N-alfa-benzoyl-D, L-arginin-p-nitroanilid). Byly optimalizovány reakční podmínky Clostripainu, a to doba aktivace enzymu, optimální reakční teplota a čas, poměr E:S. Pro imobilizaci byly vyzkoušeny různé metody kovalentní vazby. Z magnetických nosičů pro imobilizaci Clostripainu byly vybrány magnetické částice Chemicell s karboxylovými, aminovými, polyglutaraldehydovými, hydrazinovými a kyanurátovými funkčními skupinami a magnetická makroporézní perlová celulóza s -OH funkčními skupinami. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič a byla u něj stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného Clostripainu. Specifita štěpení imobilizovaným Clostripainem byla nejprve ověřena pomocí modelového proteinu melittinu, a poté byl nosič aplikován pro fragmentaci tau proteinu. Vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy a MALDI-TOF-MS.