Stanovení vybraných oxokyselin v suché kapce krve metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí

Abstract

Stanovení aminokyselin a od nich odvozených 2-oxokyselin má klíčovou úlohu v diagnostice vrozených metabolických poruch u dětí v rámci novorozeneckého screeningu. V biochemické laboratoři s klasickým vybavením se pro stanovení 2-oxokyselin využívá jako "zlatý standard" metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí, při které se 2-oxokyseliny derivatizují ortho-fenylendiaminem. Jedná se o poměrně citlivou metodu, avšak ortho-fenylendiamin je vysoce karcinogenní látka. Tato práce se zabývá stanovením vybraných 2-oxokyselin v suché kapce krve metodou HPLC s fluorescenční detekcí, s cílem nahradit ortho-fenylendiamin za jiné nekarcinogenní derivatizační činidlo a zachovat, či zvýšit citlivost dané metody. Pro derivatizaci vybraných 2-oxokyselin byly zvoleny tři derivatizační činidla, 1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzen, 1,2-diamino-4,5-methylendioxybenzen a dansylhydrazin. Při použití dansylhydrazinu je nevýhodou to, že tato látka fluoreskuje stejně jako deriváty 2-oxokyselin. U metody využívající 1,2-diamino-4,5-methylendioxybenzen jako derivatizační činidlo se nám nepodařilo ve vzorku suché kapky krve dostatečně separovat deriváty vybraných 2-oxokyselin. Byla zavedena metoda HPLC s fluorescenční detekcí pro stanovení vybraných 2-oxokyselin ve vzorcích suché kapky krve. Jako derivatizační činidlo byl použit 1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzen, přičemž vzniklé deriváty mnohem silněji fluoreskovaly v porovnání s metodou využívající pro derivatizaci 2-oxokyselin ortho-fenylendiamin. Deriváty 2-oxokyselin byly separovány v systému obrácených fází (analytická kolona LiChroCart 125 x 4 mm, Purospher Star RP-18e, 5 um, opatřená ochranou kolonou LiChroCart 4 x 4 mm, Purospher Star RP-18e, 5 um) gradientovou elucí. Mobilní fází A byla směs acetonitrilu a deionizované vody (25:75; v/v) a mobilní fází B byl 100% acetonitril. Přesnost v sérii pro stanovení vybraných 2-oxokyselin ve vzorcích suché kapky krve byla vyhovující, variační koeficienty se pohybovaly pod 5 %. Kalibrační křivky byly lineární v rozsahu testovaných koncentrací, s výjimkou 2-oxobutyrátu, kde byl průběh z nejasných důvodů kvadratický. Orientační hladiny vybraných 2-oxokyselin u 14 dobrovolných dárců jsou porovnatelné s literárními údaji. Fenylpyruvát byl detegován jen u některých dárců krve.