Stanovení vybraných oxokyselin v suché kapce krve metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí

Tůmová, Irena

Publikace:
Stanovení vybraných oxokyselin v suché kapce krve metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí

Diplomová práceopen access

dc.contributor.advisor	Kanďár, Roman
dc.contributor.author	Tůmová, Irena
dc.date.accepted	2018-06-04
dc.date.accessioned	2018-06-14T06:04:04Z
dc.date.available	2018-06-14T06:04:04Z
dc.date.issued	2018
dc.date.submitted	2018-05-10
dc.description.abstract	Stanovení aminokyselin a od nich odvozených 2-oxokyselin má klíčovou úlohu v diagnostice vrozených metabolických poruch u dětí v rámci novorozeneckého screeningu. V biochemické laboratoři s klasickým vybavením se pro stanovení 2-oxokyselin využívá jako "zlatý standard" metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí, při které se 2-oxokyseliny derivatizují ortho-fenylendiaminem. Jedná se o poměrně citlivou metodu, avšak ortho-fenylendiamin je vysoce karcinogenní látka. Tato práce se zabývá stanovením vybraných 2-oxokyselin v suché kapce krve metodou HPLC s fluorescenční detekcí, s cílem nahradit ortho-fenylendiamin za jiné nekarcinogenní derivatizační činidlo a zachovat, či zvýšit citlivost dané metody. Pro derivatizaci vybraných 2-oxokyselin byly zvoleny tři derivatizační činidla, 1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzen, 1,2-diamino-4,5-methylendioxybenzen a dansylhydrazin. Při použití dansylhydrazinu je nevýhodou to, že tato látka fluoreskuje stejně jako deriváty 2-oxokyselin. U metody využívající 1,2-diamino-4,5-methylendioxybenzen jako derivatizační činidlo se nám nepodařilo ve vzorku suché kapky krve dostatečně separovat deriváty vybraných 2-oxokyselin. Byla zavedena metoda HPLC s fluorescenční detekcí pro stanovení vybraných 2-oxokyselin ve vzorcích suché kapky krve. Jako derivatizační činidlo byl použit 1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzen, přičemž vzniklé deriváty mnohem silněji fluoreskovaly v porovnání s metodou využívající pro derivatizaci 2-oxokyselin ortho-fenylendiamin. Deriváty 2-oxokyselin byly separovány v systému obrácených fází (analytická kolona LiChroCart 125 x 4 mm, Purospher Star RP-18e, 5 um, opatřená ochranou kolonou LiChroCart 4 x 4 mm, Purospher Star RP-18e, 5 um) gradientovou elucí. Mobilní fází A byla směs acetonitrilu a deionizované vody (25:75; v/v) a mobilní fází B byl 100% acetonitril. Přesnost v sérii pro stanovení vybraných 2-oxokyselin ve vzorcích suché kapky krve byla vyhovující, variační koeficienty se pohybovaly pod 5 %. Kalibrační křivky byly lineární v rozsahu testovaných koncentrací, s výjimkou 2-oxobutyrátu, kde byl průběh z nejasných důvodů kvadratický. Orientační hladiny vybraných 2-oxokyselin u 14 dobrovolných dárců jsou porovnatelné s literárními údaji. Fenylpyruvát byl detegován jen u některých dárců krve.	cze
dc.description.abstract-translated	The determination of amino acids and keto acids play a key role in the diagnosis of congenital metabolic diseases, which is part of the new-born screening. The HPLC method with fluorescence detection is "golden standard", which is used for a determination of keto acids in biochemical laboratories with a basic equipment. The HPLC method uses ortho-phenylenediamine for the derivatization of keto acids. It is relatively sensitive method, but ortho-phenylenediamine is a highly carcinogenic substance. This thesis deals with the determination of keto acids in dried blood spots by an HPLC with fluorescence detection and replacing ortho-phenylenediamine with another non-carcinogenic derivatizing agent to maintain or increase the sensitivity of the method. Three derivatizing agents were chosen for a derivatization of keto acids, 1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzene, 1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene and dansylhydrazine. The major disadvantage of dansylhydrazine is that it emits fluorescence as much as derivatives of keto acids. We didn't succeed in a sufficient separation of keto acids in dried blood spots after the derivatization with 1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene. The HPLC method with fluorescence detection of keto acids in dried blood spots was established. 1,2-Diamino-4,5-dimethoxybenzene was used as the derivatizing agent. The derivatives of keto acids emit fluorescence much more than the derivatives after the derivatization with ortho-phenylenediamine. The derivatives of keto acids were separated by reversed-phase HPLC with gradient elution (an analytical column LiChroCart 125 x 4 mm, Purospher Star RP-18e, 5 um, connected with guard column LiChroCart 4 x 4 mm, Purospher Star RP-18e, 5 um). The mobile phase A was a mixture of acetonitrile and deionized water (25:75; v/v) and mobile phase B was 100% acetonitrile. The intra-assay precision of presented HPLC method was satisfactory, the coefficients of variation were under 5 %. The calibration curves were linear over the tested range for keto acids except 2-ketobutyrate, calibration curve was quadratic, the reason is unclear. The orientation levels of selected keto acid in dried blood spots obtained from 14 volunteers are comparable to literature data. We detected phenyl pyruvate only in some blood donors.	eng
dc.description.defence	1. Prezentace výsledků diplomové práce. 2. Diskuze k posudku vedoucího a oponenta diplomové práce. 3. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP.	cze
dc.description.department	Fakulta chemicko-technologická	cze
dc.description.grade	Dokončená práce s úspěšnou obhajobou	cze
dc.format	95 s. (150 273 znaků)
dc.identifier	Univerzitní knihovna (studovna)	cze
dc.identifier.signature	D37627
dc.identifier.stag	35332
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/10195/70800
dc.language.iso	cze
dc.publisher	Univerzita Pardubice	cze
dc.rights	bez omezení	cze
dc.subject	2-oxokyseliny	cze
dc.subject	suchá krevní kapka	cze
dc.subject	derivatizace	cze
dc.subject	HPLC	cze
dc.subject	fluorescenční detekce	cze
dc.subject	keto acids	eng
dc.subject	dried blood spot	eng
dc.subject	derivatization	eng
dc.subject	HPLC	eng
dc.subject	fluorescence detection	eng
dc.thesis.degree-discipline	Bioanalytik	cze
dc.thesis.degree-grantor	Univerzita Pardubice. Fakulta chemicko-technologická	cze
dc.thesis.degree-name	Mgr.
dc.thesis.degree-program	Speciální chemicko-biologické obory	cze
dc.title	Stanovení vybraných oxokyselin v suché kapce krve metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí	cze
dc.title.alternative	Determination of selected keto acids in dried blood spot using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection	eng
dc.type	diplomová práce	cze
dspace.entity.type	Publication