Specifické C-terminální endoproteinázy: kinetika, imobilizace, aplikace

Abstract

Diplomová práce byla zaměřena na přípravu magnetického mikroreaktoru s imobilizovanou endoproteinázou Arg-C (Clostripain). Jako vhodné nosiče byly vybrány magnetické částice s karboxylovými, aminovými, hydrazidovými, kyanurátovými a polyglutaraldehydovými funkčními skupinami. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič, u něhož byla také stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného Clostripainu. Aktivita solubilního a imobilizovaného Clostripainu byla ověřena pomocí substrátu BAEE (N?-benzoyl-L-arginin-ester). Přírustek produktu byl měřen kineticky jako závislost změny absorbance na čase. Z kinetických údajů byla pro solubilní a imobilizovaný Clostripain stanovena Michaelisova konstanta, charakterizující katalytické vlastnosti enzymu vzhledem k příslušnému substrátu. V poslední části diplomové práce byla ověřena specifita obou forem Clostripainu pomocí štěpení modelového proteinu BSA (hovězí sérový albumin). Byly optimalizovány podmínky enzymové fragmentace (teplota, doba štěpení, poměr E:S). Vzorky byly analyzovány elektroforeticky pomocí SDS-PAGE a pomocí MALDI-TOF-MS.