Využití H/D výměny ke studiu strukturních změn proteinového komplexu Tomm34 a Hsp70/90

Abstract

Cílem diplomové práce byla analýza interakce proteinu Tomm34 s peptidy Hsp70/Hsp90 metodou H/D výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií.

Dílčími cíli bylo: (1) optimalizovat přípravu vzorku pro H/D výměnu, (2) provést peptidové mapování proteinu Tomm34 a (3) popsat jeho strukturu. Prvním krokem byla optimalizace přípravy vzorku pro H/D výměnu. Experimentálně bylo stanoveno množství přidávaného glycinu, který byl použit k zastavení H/D výměny tak, aby dané množství zajistilo pokles pH na požadovanou hodnotu. Dalším krokem bylo peptidové mapování proteinu Tomm34 po štěpení na koloně s imobilizovaným pepsinem. Informace o detekovaných peptidech byly použity k vyhledání odpovídajících peptidů v hmotnostních spektrech deuterovaných vzorků. Experiment H/D výměny byl proveden pro samostatný protein Tomm34, pro Tomm34 v komplexu s C-koncovým peptidem Hsp70 a pro Tomm34 v komplexu s C-koncovým peptidem Hsp90. Získaná data ukázala, že protein Tomm34 interaguje s peptidy Hsp70 i Hsp90. Domény TPR1 a TPR2 proteinu Tomm34 byly specificky chráněny proti výměně amidových vodíků oběma peptidy. Doména TPR1 byla preferenčně chráněná peptidem Hsp70 a doména TPR2 byla preferenčně chráněná peptidem Hsp90.