HPLC/MS charakterizace regioizomerních směsí triacylglycerolů

Abstract

Disertační práce se zabývá analýzou komplexních směsí triacylglycerolů, které představují významnou součást naší potravy a mají důležitou roli při mnoha biologických procesech v lidském organizmu. Předkládaný text shrnuje výsledky dosažené při separacích a následných identifikacích triacylglycerolů a jejich regioizomerů obsažených v rostlinných olejích, živočišných tucích a randomizačních směsích. Získané výsledky byly uvedeny ve čtyřech publikacích uveřejněných v mezinárodních odborných časopisech. Jednotlivé triacylglyceroly se mezi sebou mohou lišit v mnoha parametrech. Kombinací triacylglycerolů se v přírodě vytvářejí složité směsi, které není možné bez jejich předchozí důkladné separace identifikovat. Za účelem získání maximálního počtu separovaných triacylglycerolů byly optimalizovány chromatografické podmínky v systému argentační chromatografie. Bylo zjištěno, že složení mobilní fáze a délka chromatografické kolony měly významný vliv na účinnost separace triacylglycerolů a především jejich regioizomerů. V optimalizovaném systému byly analyzovány vzorky rostlinných olejů, živočišných tuků a randomizačních směsí, pro které bylo následně popsáno retenční chování příslušných triacylglycerolů včetně jejich regioizomerů. Dále bylo popsáno retenční chování cis-/trans- izomerů a triacylglycerolů obsahujících neobvyklé mastné kyseliny. Pomocí off-line dvourozměrné chromatografie byly studovány možnosti separace komplexních přírodních směsí triacylglycerolů. Sběr frakcí byl realizován v nevodném systému s obrácenými fázemi a jejich následná separace byla provedena v systému argentační chromatografie. Ortogonalita obou separačních systémů byla testována pro přírodní vzorky triacylglycerolů a jejich regioizomerů, které obsahovaly mastné kyseliny s rozdílnou délkou acylového řetězce, počtem, polohou a geometrií dvojných vazeb a různou regiozomerickou polohou mastných kyselin na skeletu glycerolu. Off-line dvourozměrná chromatografie obou komplementárních módů přinesla lepší chromatografickou selektivitu, která vedla k vyššímu počtu identifikovaných triacylglycerolů. Optimalizace podmínek randomizační reakce umožnila připravit ze zvolených standardů jednoduchých triacylglycerolů příslušné regioizomery. Randomizační reakci bylo možné použít pro jakýkoli počet a druh jednoduchých standardů triacylglycerolů. Tato reakce byla ověřena na reálných vzorcích rostlinných olejů a dále byla používána k přípravě různých syntetických směsí regioizomerů. Jednotlivé triacylglyceroly, které byly separovány při analýzách, byly identifikovány hmotnostním spektrometrem s chemickou ionizací za atmosférického tlaku (APCI-MS). Pro identifikované triacylglyceroly byly popsány významné fragmentové ionty pozorované v APCI hmotnostních spektrech a byla určena převládající mastná kyselina v poloze sn-2. Pomocí popsaných fragmentových iontů bylo uskutečněno srovnání pěti různých hmotnostních spektrometrů. Bylo zjištěno, že vliv odlišných typů hmotnostních analyzátorů byl nižší ve srovnání s efektem počtu dvojných vazeb, jejich polohy na acylovém řetězci a regiospecifické distribuci acylových řetězců na skeletu glycerolu.