Metody sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie

Abstract

Tato diplomová práce, spadající do odvětví proteomiky, je zaměřena na metody sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie. Teoretická část práce se zabývá zejména charakteristikou aminokyselin, peptidů a bílkovin. Součástí teorie je i shromáždění základních informací o separačních technikách proteinů a hmotnostní spektrometrii, které tvoří základní proteomické nástroje pro analýzu proteinových vzorků. Další část teoretické práce je věnována metodám sekvenování proteinů/peptidů, interpretaci tandemových spekter a přehledu technik úpravy vzorku, které usnadňují interpretaci informace o peptidových sekvencích z tandemových hmotnostních spekter. Experimentální část obsahuje přípravu modelového vzorku směsi peptidů z koňského myoglobinu, zahrnující tryptické štěpení v roztoku a purifikaci peptidů pomocí extrakce na pevné fázi. Dále obsahuje provedení a optimalizaci vybraných technik modifikace vzorku na připravené modelové směsi peptidů a nakonec také přípravu reálného vzorku směsi peptidů neznámého vzorku tryptickým štěpením v gelu za použití optimalizovaných podmínek úpravy vzorku. Použité techniky byly obvykle spojeny s aplikací mikrogradientového zařízení za účelem purifikace nebo separace vzorku. Výsledky analýzy reálného vzorku byly použity pro částečnou de novo sekvenaci analyzovaného proteinu a také jeho identifikaci pomocí databázového vyhledávání. Uvedené postupy a získané výsledky vedly především k zjednodušení derivatizačních protokolů prováděných na stacionární fázi v kolonce a k jejich účinné aplikaci pro analýzu reálných vzorků proteinů separovaných pomocí gelové elektroforézy.