Příprava proteinů v umělých expresních systémech a analýza proteinových interakcí

Abstract

Tato práce byla zaměřena na možnosti využití separačních chromatografických metod pro výrobu dvou konkrétních proteinů Air-2 (Aurora - Related serine\ threonine dinase) a Bir-1 (Baculovirus Inhibitory Repeat) z modelového organismu C.elegans. Proteiny byly identifikovány a následně bylo snahou prokázat vazebnou interakci mezi nimi. Sekvence genů Air-2 (Aurora - Related serine\ threonine dinase) a Bir-1 (Baculovirus Inhibitory Repeat) byla naklonována do speciálního expresního vektoru. Pro Air-2 byl použit pET 28 a pro Bir-1 vektor pGEX 2T. Tyto konstrukty umožní po transformaci do vhodných buněk (E.coli) expresi proteinu. Proteiny byly z buněk izolovány chemicky i mechanicky a následně identifikovány. Proteiny Air-2 a Bir-1 byly izolovány afinitní chromatografií a poté detegovány za použití nespecifických metod jako je barvení metodu Coomassie Brilliant blue nebo barvení stříbrem.V případě proteinu Bir-1 byla identifikace i hmotnostní spektrometrií. Dále byla u obu proteinů snaha prokázat vazebnou interakci mezi sebou.Tento experiment byl však ověřen pouze nespecifickou identifikaci.