Hmotnostně spektrometrická charakterizace sfingolipidů a glykosfingolipidů v biologických vzorcích

Abstract

Tato práce se zabývá analýzou lipidů, jež mohou mít vliv na mnohdy fatální onemocnění. Lipidy jsou především důležitou součástí všech biologických tkaní s řadou důležitých funkcí v organismu. Základem lipidomických studií je identifikace a kvantifikace lipidů v biologických vzorcích. Detailní informace o celém lipidomu jsme schopni získat pomoci separačních technik ve spojení s hmotnostní. Vzhledem k velké komplexnosti lipidů je jejich identifikace a kvantifikace stále velmi náročným úkolem. První část této práce se věnuje vývoji nové metody využívající chromatografii hydrofilních interakcí (HILIC), ve spojení s hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrosprejem (ESI-MS), ke komplexní charakterizaci sfingolipidů, zejména pak gangliosidů a ostatních polárních lipidů v biologických vzorcích. Předně došlo k extrakci lipidů pomocí směsi chloroformu, metanolu a vody, kde vrchní vodná fáze obsahující gangliosidy a další polární lipidy byla přečištěna pomocí extrakce tuhou fází, kdy byla použita stacionární fáze C18. Následně byly testovány podmínky chromatografické separace za účelem dosáhnout nejlepšího rozlišeni a intenzity separovaných tříd lipidů. Pro separaci byla použita povrchově porézní kolona Ascentis Si (150 x 2.1, velikost částic 3µm). Byla testována různá koncentrace jednotlivých aditiv a pH mobilní fáze. Výsledek ukázal, že koncentrace aditiv a pH mobilní fáze nemá významný vliv pouze na separaci, ale také na intenzitu separovaných lipidů. Lipidy byly identifikovány s vysokou jistotou na základě přesné hodnoty m/z [M-H]- iontů a fragmentových iontů (MS/MS) měřených pomocí vysoko rozlišujícího hmotnostního spektrometru. Díky detailní interpretaci fragmentačních spekter bylo umožněno zobecnění fragmentačních cest, což umožnilo následné zařazení gangliosidů do série a, b či c. Strukturní přiřazení bylo dále ve shodě s předpokládaným retenčním chováním v chromatografickém modu HILIC, na základě korelace mezi retencí gangliosidů, počtem sacharidových jednotek a jejich sekvencí. Finální HILIC/ESI-MS/MS metoda byla použita pro analýzu prasečího mozku, lidských ledvin, plic, plasmy a erytrocytů. Pomocí 15 minutové LC/MS analýzy bylo identifikováno 145 jednotlivých gangliosidů z 19 třid, 71 sulfatidů a 59 polárních fosfolipidů (fosfatidylserinu, fosfatidylinositolu, lysofosfatidylinositolu a fosfatidylglycerolu). Další část této práce se zaměřuje na optimalizaci HILIC/ESI-MS metody pro kvantitativní analýzu gangliosidů (GM3) a ostatních polárních lipidů jako jsou sulfatidy, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, lysofosfatidylinositoly a fosfatidylseriny. Metoda byla validována pro kvantitativní studii lipidů v nádorové tkáni a okolní zdravé tkáni ledvin u pacientů trpících karcinomem ledvin (renal cell carcinoma, RCC). Kvantifikace probíhala na základě separace jednotlivých tříd a koeluce interního standardu náležícího pro danou třídu. Naměřená data byla semikvantitativně procesována pomocí softwaru LipidQuant a statisticky vyhodnocena pomocí vícerozměrné statistické analýzy dat (MDA), což umožnilo kompletní rozdělení obou skupin se 100 % specificitou a sensitivitou. Celkově, tak bylo identifikováno 115 jednotlivých lipidů ze sedmy tříd ve 40 vzorcích nádorové tkáně a okolní zdravé tkáně ledvin. Pro nejvýznamnější vybrané lipidy byly vytvořeny box ploty a vypočítány parametry určující významnost lipidů jako je: fold change, T hodnota a p hodnota.