Digitální knihovnaUPCE
 

Využití HPLC/ED k monitorování některých klinicky významných sirných sloučenin

Disertační práceOtevřený přístup

Abstrakt

Cílem této práce bylo (a) vyvinout vhodnou metodu pro stanovení endogenních hladin kyseliny lipoové, (b) ověřit, zda je tato metoda vhodná i pro stanovení hladin kyseliny lipoové po suplementaci, (c) určit cytotoxicitu kyseliny lipoové na erytrocyty, (d) ověřit význam homocysteinu jako biomarkeru v klinické praxi, získat obecný přehled o celkovém metabolismu methioninu u pacientů s onemocněním koronárních arterii a ověřit okamžitý vliv perkutánní koronární intervence na hladiny methioninu a jeho metabolitů. (a) Cílem bylo vyvinout vhodnou metodu pro stanovení hladin volné kyseliny lipoové. Jedná se o vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s elektrochemickou detekcí. Vzorky krve byly získány od 40 dobrovolných darců, kteří splňovali podmínky pro zapsání do registru dárců. Tito dárci nebyli suplementováni kyselinou lipoovou. Při stanovení kyseliny lipoové v plasmě byly vzorky krve odstředěny a získaná plasma byla deproteinována acetonitrilem. Po odstředění následovala extrakce na pevné fázi a kyselina lipoová byla eluována z kolonky methanolem. Eluát byl odpařen do sucha v atmosféře dusíku. Odparek byl rozpuštěn ve směsi acetonitrilu a deionizované vody, po filtraci byl vzorek dávkován na analytickou kolonu s vázanou reverzní fází. Limit detekce a kvantifikace této metody byl 1,85 a 5,18 nmol/l. Dosáhli jsme nižší hodnoty meze detekce v porovnání s předchozími studiemi (2,4 a 4,9 nmol/l), které se zabývaly stanovením volné kyseliny lipoové u nesuplementovaných jedinců. Nicméně. i přesto jsme hladiny kyseliny lipoové v plasmě u všech 40 dobrovolných dárců nedetekovali. Výsledky naší studie ukazuji, že endogenní koncentrace volné kyseliny lipoové v plasmě jsou pravděpodobně nižší než 1,85 nmol/l. (b) Tato metoda byla využita k ověření hladin kyseliny lipoové v plasmě. u suplementovaných dobrovolných dárců a je tak vhodná pro studie zabývající se stanovením hladin kyseliny lipoové u suplementovaných pacientů. (c) Byl sledován vliv kyseliny lipoové na životaschopnost (viabilitu) erytrocytů. Vzorky krve byly získány od dobrovolných nesuplementovaných dárců. Krev byla odstředěna při 750 x g, separované erytrocyty byly celkem 3x promyty fosfátovým pufrem, následně naředěny Ringerovým roztokem a dávkovány do 12jamkových kultivačních destiček. K suspenzi erytrocytů byly přidány různě naředěné roztoky kyseliny lipoové. Inkubace probíhala 24 a 48 hodin při 37 °C. K stanoveni viability buněk byla použita metoda vylučovaní trypanové modři. Námi testované koncentrace kyseliny lipoové (1, 5 a 10 μmol/l) nezpůsobily ani po 48hodinové inkubaci statisticky významné změny ve viabilitě ani počtu erytrocytů oproti kontrole. Také žádná z testovaných vysokých koncentrací (50, 100, 250 μmol/l) kyseliny lipoové nezpůsobila statisticky významné změny ve viabilitě erytrocytů. Na počet erytrocytů měly vysoké koncentrace statisticky významný vliv již po 24hodinové inkubaci. (d) Hladiny celkového homocysteinu, cysteinu, methioninu a cysteinyl-glycinu v plasmě byly stanoveny metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s coulometrickou detekci. Důvodem byla rychlá příprava vzorku bez nutnosti derivatizace a nižší finanční nároky oproti jiným metodám. Vzorky krve byly získány od 68 pacientů s prokázaným onemocněním koronárních artérii, kteří byli rozděleni do tří skupin dle stupně závažnosti onemocnění. Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v prevalenci diabetu, pre-diabetu a onemocnění ledvin mezi sledovanými skupinami, rovněž mezi kuřáky, nekuřáky i pacienty s normálním a zvýšeným krevním tlakem. Byly zjištěny signifikantní rozdíly v hladinách albuminu, celkového cholesterolu, LDL-cholesterolu a stupně indexu aterogenity u sledovaných skupin pacientů. Byly zjištěny statisticky významně zvýšené hladiny homocysteinu u pacientů s akutní formou onemocnění v porovnání s pacienty trpící chronickou formou tohoto onemocnění. Naše výsledky podporují hypotézu, že homocystein nelze využít pro včasnou diagnostiku stenózy v koronárních arteriích, ale zdá se, že by mohl být dobrým biomarkerem závažnosti již prokázaného onemocnění koronárních artérií. Zvýšené hladiny homocysteinu korelují s nestabilitou onemocnění a nutností léčby. U pacientů, u nichž došlo k dokončení revaskularizace, statisticky významně poklesly hladiny cysteinu, cysteinyl-glycinu a methioninu před druhou intervencí v porovnání s pacienty mající akutní a chronickou formu onemocnění. Tento stav je pravděpodobně spojen se zvýšeným oxidačním stresem, kdy je preferována transsulfurační dráha, která zvyšuje spotřebu cysteinu. Zdá se tedy, že cystein hraje důležitou úlohu v organismu jako antioxidant než jako rizikový faktor u pacientů s onemocněním koronárních artérií. Z této skupiny pacientů bylo vybráno 44 pacientů, u kterých následovala po angiografii perkutánní koronární intervence. Vzorky krve byly odebírány ve třech časových bodech, před zákrokem, 24 a 48 hodin po intervenci. Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v hladinách homocysteinu a cysteinu před zákrokem, 24 a 48 hodin po zákroku. Hladiny methioninu a cysteinyl-glycinu byly signifikantně vyšší 24 a 48 hodinách po intervenci ve srovnání s hladinami před zákrokem.

Rozsah stran

150 s.

ISSN

Trvalý odkaz na tento záznam

Projekt

Zdrojový dokument

Vydavatelská verze

Přístup k e-verzi

Bez omezení

Název akce

ISBN

Studijní obor

Analytická chemie

Studijní program

Analytická chemie

Signatura tištěné verze

D38595

Umístění tištěné verze

Univerzitní knihovna (studovna)

Přístup k tištěné verzi

Klíčová slova

cytotoxicita, cytotoxicity, elektrochemická detekce, erytrocyty, homocystein, kyselina lipoová, onemocnění koronárních artérií, perkutánní koronární intervence, plasma, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, electrochemical detection, erythrocytes, homocysteine, lipoic acid, coronary artery disease, percutaneous coronary intervention, plasma, high-performance liquid chromatography

Endorsement

Review

item.page.supplemented

item.page.referenced