Charakterizace lipidů v biologických vzorcích s využitím kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie

Abstract

Prvni .ast teto prace byla v.novana vyvoji nove metody komprehensivni dvoudimenzionalni kapalinove chromatografie (2D-LC) vyu.ivajici ionizaci elektrosprejem (ESI) s hmotnostni detekci ke komplexni lipidomicke charakterizaci vybranych biologickych vzork.. V prvni dimenzi (D1) byla vyu.ita ultra-vysokou.inna kapalinova chromatografie v systemech s obracenymi fazemi (RP-UHPLC) s kolonou obsahujici oktadecylsilikagelovou stacionarni fazi (150 mm x 1 mm, velikost .astic 1,7 ?Ęm). Tato metoda umo.nila separaci lipid. li.icich se svou hydrofobni .asti molekuly, zejmena pak delkou .et.zc. navazanych mastnych kyselin (FA) a po.tem a polohou dvojnych vazeb (DB). Pomoci chromatografie hydrofilnich interakci (HILIC) v druhe dimenzi (D2), bylo dosa.eno rozd.leni koeluujicich t.id lipid. na zaklad. jejich polarit. Pro HILIC separaci byla vyu.ita silikagelova kolona s povrchov. poreznimi .asticemi (50 mm x 3 mm, velikost .astic 2,7 ?Ęm). Reten.ni .asy z obou dimenzi, p.esne hodnoty m/z a tandemova hmotnostni spektra poskytla vysokou jistotu v ramci identifikace jednotlivych lipid.. Reten.ni chovani lipid. v RP-UHPLC se .idi podle pravidla tzv. ekvivalentniho po.tu uhlik. (ECN), co. poskytuje dal.i potvrzeni spravnosti identifikaci. Vysledkem komprehensivni 2D-LC/ESI-MS metody byla identifikace 143 druh. lipid. ze 4 kategorii a 10 t.id ve vzorcich lidske krevni plazmy a mozku prasete domaciho. Druha .ast teto prace byla v.novana optimalizaci nove RP-UHPLC/ESI-MS metody vyu.ivajici dv. seriov. zapojene kolony o celkove delce 30 cm s .asticemi o velikosti men.i ne. 2 ?Ęm za u.elem separace a identifikace velkeho po.tu lipid. v biologickych vzorcich. K detekci lipid. byl pou.it hybridni hmotnostni spektrometr s vysokym rozli.enim typu kvadrupol s analyzatorem doby letu (QTOF). K ionizaci byla vyu.ita ESI se zaznamem kladnych i zapornych iont.. Ve v.t.in. p.ipad. bylo dosa.eno p.esnosti ur.eni hmoty lep.i ne. 5 ppm, .eho. bylo vyu.ito p.i identifikaci jednotlivych lipid.. Celkov. bylo identifikovano vice ne. 400 lipid. z 14 polarnich a nepolarnich t.id lipid. z 5 kategorii. Jako vzorky byly pou.ity lidska krevni plazma, lidske erytrocyty, lidska mo. a mozkova tka. prasete domaciho. Dale byla tato prace zam..ena na studii reten.niho chovani lipid. v RP-UHPLC pomoci sestaveni obecnych zavislosti relativnich reten.nich .as. na relativnim po.tu uhlik. (CN) nebo na relativnim po.tu DB. Tyto zavislosti byly navr.eny na zaklad. polynomicke regrese druhého stupně. Pravidelné retenční chování v homologických sériích lipidů poskytuje další významný identifikační bod v lipidomické analýze využívající ultra-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii ve spojení s hmotnostní spektrometrií (UHPLC/MS), což zvyšuje jistotu identifikace jednotlivých lipidů. Využitím údajů z dříve publikovaných prací v režimu kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi (RP-LC) a ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie (UHPSFC) byla dokázána obecná použitelnost polynomické závislosti pro popis retenčního chování a predikci retenčních časů. Poslední část této disertační práce byla zaměřena na shotgun MS kvantitativní analýzu vzorků nádorových a sousedních zdravých tkání, které byly získány od pacientů trpících histopatologicky potvrzeným nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC). Získaná data byla analyzována pomocí softwaru LipidQuant, díky kterému bylo ve vzorcích plic identifikováno celkem 314 lipidů. Získaná kvantitativní data byla dále vyhodnocena s využitím vícerozměrné statistické analýzy dat (MDA). Pro charakterizaci statisticky významných rozdílů identifikovaných lipidů v obou typech tkání byla využita nesupervizovaná analýza hlavních komponent (PCA) a supervizovaná ortogonální metoda nejmenších čtverců (OPLS). Pomocí metody OPLS bylo určeno 10 druhů lipidů se zvýšenou nebo sníženou koncentrací značících statisticky významné rozdíly mezi nádorovou a zdravou tkání plic.