Optimalizace podmínek purifikace enzymů z biologického materiálu
Diplomová práceOmezený přístupDatum publikování
2016
Autoři
Vedoucí práce
Oponent
Název časopisu
Název svazku
Vydavatel
Univerzita Pardubice
Abstrakt
Glutathionreduktáza (GR) je enzym patřící do třídy oxidoreduktáz. Uplatnění nachází při přeměně oxidované formy glutathionu na redukovanou. Glutathion se v organizmu podílí na celé řadě fyziologických a metabolických funkcí. Glutathion především chrání organizmus před oxidačním stresem. Dále pak udržuje vitamíny v redukované formě, podílí se na detoxikaci xenobiotikých látek a transportu aminokyselin přes buněčnou membránu, a udržuje redukční prostředí v erytrocytech.
Nejčastěji využívanými metodami při purifikaci glutathionreduktázy jsou v současnosti precipitace síranem amonným, dialýza a afinitní chromatografie. Cílem naší práce bylo optimalizovat jednotlivé kroky purifikace a jejich parametry, abychom zkrátili čas purifikace a zvýšili její účinnost.
Testovali jsme optimální koncentraci síranu amonného při precipitaci standardu glutathionreduktázy a následně jsme tento pokus opakovali s lidskou krví. V případě precipitace standardu jsme určili jako optimální pro precipitaci glutathionreduktázy rozmezí saturace síranu amonného 50 % až 80 %. Poté jsme testovali optimální saturaci síranu amonného pro precipitaci GR na vzorku se složitější matricí (lyzovaných lidských erytrocytech). V tomto případě byla nalezená optimální saturace v rozmezí 4060 %. Při tomto pokusu bylo zjištěno, že při saturaci 50-60 % síranu amonného precipituje z roztoku lyzovaných erytrocytů většina proteinů. V dalším pokuse jsme navázali standard glutathionreduktázy na stacionární fázi afinitní chromatografie (2´,5´-ADP-agrarózu). Následně jsme provedli eluci GR, zachycení eluované mobilní fáze do mikrozkumavek a stanovení aktivity GR a koncentrace proteinů v eluovaném roztoku. V rámci další práce byla provedena kompletní purifikace glutathionreduktázy z odebraného vzorku krve. V tomto pokusu jsme získali glutathionreduktázu z lyzovaných lidských erytrocytů pomocí precipitace síranem amonným, dialýzy a afinitní chromatografie s výtěžkem 23 % a se stupněm očištění 4780.
Rozsah stran
67 s.
ISSN
Trvalý odkaz na tento záznam
Projekt
Zdrojový dokument
Vydavatelská verze
Přístup k e-verzi
Práce není přístupná
Název akce
ISBN
Studijní obor
Analýza biologických materiálů
Studijní program
Speciální chemicko-biologické obory
Signatura tištěné verze
D34766
Umístění tištěné verze
Univerzitní knihovna (studovna)
Přístup k tištěné verzi
Klíčová slova
glutathion, glutathionreduktáza, purifikace, afinitní chromatografie, glutathion, glutathion reductase, purification, affinity chromatography