Porovnání metod pro stanovení proteinů v biologickém materiálu

Abstract

Proteiny jsou řazeny mezi základní živiny všech živých organismů, které jsou složeny z aminokyselinových zbytků. Proteiny se vyznačují celou řadou důležitých funkcí, například stavební, ochrannou nebo transportní. V současné době existují různé metody, které jsou využívány pro stanovení koncentrace proteinů v různých vzorcích. Tyto metody jsou nejčastěji spektrofotometrické, ale také imunochemické či fluorimetrické. Cílem naší práce bylo optimalizovat dvě zvolené metody pro stanovení koncentrace proteinů. Jednalo se o metodu dle Bradforda a o metodu s kyselinou bicinchoninovou. Dalším cílem naší práce bylo porovnat obě metody mezi sebou, charakterizovat jejich využití u biologických vzorků a prokázat možné interferující látky. Pro optimalizaci obou metod jsme připravili kalibrační řadu standardního hovězího albuminu. Z naměřené absorbance kalibrační řady jsme určili lineární rozsah kalibrace BSA v rozmezí koncentrací od 0 do 100 g/ml. Dále jsme hledali optimální teplotu či dobu inkubace pro testování stability vznikajícího komplexu. Pro metodu dle Bradforda jsme zvolili jako optimální laboratorní teplotu. U metody s kyselinou bicinchoninovou se jevila optimální teplota 37 °C, ale z důvodu co nejbližšího porovnání metod jsme využívali teplotu laboratorní. Obě metody jsme využili také pro stanovení koncentrace proteinů v biologickém materiálu, kterým byly homogenáty myší jaterní a ledvinné tkáně. V rámci stanovení interference jsme použili několik aminokyselin a látek s biologickým účinkem. Všechny aminokyseliny jsme vyhodnotili jako látky neinterferující u obou metod. V případě látek s biologickým účinkem jsme prokázali interferenci u metody s kyselinou bicinchoninovou; jednalo se o quercetin a acetaminofen, u něhož jsme prokázali interferenci u koncentrací nad 1 mol/l. Na základě našich výsledků lze říci, že obě metody jsou jednoduché, rychlé a vhodné pro stanovení koncentrace proteinů ve standardních vzorcích, v případě předpokládané interference je ale vhodnější použít metodu dle Bradforda.