| dc.contributor.advisor |
Holčapek, Michal |
cze |
| dc.contributor.author |
Cífková, Eva |
|
| dc.date.accessioned |
2013-03-08T09:38:33Z |
|
| dc.date.available |
2013-03-08T09:38:33Z |
|
| dc.date.issued |
2013 |
|
| dc.identifier |
Univerzitní knihovna (studovna) |
cze |
| dc.identifier.uri |
http://hdl.handle.net/10195/49038 |
|
| dc.description.abstract |
Lipidy jsou důležitou složkou všech biologických tkání s řadou důležitých rolí
souvisejících se správnou funkcí organismu. Základním požadavkem lipidomických studií
je identifikace a kvantifikace velkého množství lipidů ve složitých biologických vzorcích.
Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií má velký
potenciál získat detailní informace o celém lipidomu, ale spolehlivá identifikace a
kvantifikace všech tříd lipidů je stále náročný úkol kvůli velké komplexitě vzorků lipidů a
jejich amfipatickému charakteru.
V první dimenzi byl celkový extrakt lipidů separován pomocí kapalinové
chromatografie hydrofilních interakcí (HILIC) na jednotlivé třídy lipidů. Podmínky HILIC
separace byly optimalizovány za účelem dosáhnout co největšího počtu separovaných tříd
lipidů. Byl testován vliv náplně kolony, složení mobilní fáze, teploty kolony a sklonu
gradientu na účinnost separace. Bylo zjištěno, že množství vody v mobilní fázi má zásadní
vliv na selektivitu a účinnost separace. Optimalizovaná HILIC metoda umožnila separaci
16 tříd lipidů a 3 regioisomerních párů v jedné analýze. Jednotlivé třídy lipidů byly
identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem (ESI-MS). Pro
získání detailních informací byly frakce separovaných tříd lipidů v první dimenzi
preparativně izolovány a separovány v druhé dimenzi pomocí vysokoúčinné kapalinové
chromatografie v systémech s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na jednotlivé lipidy. Stejně
jako pro HILIC separaci, zvláštní pozornost byla věnována optimalizaci podmínek za
účelem dosažení maximálního počtu separovaných lipidů. Jednotlivé polární lipidy byly
identifikovány pomocí ESI-MS, zatímco nepolární lipidy pomocí chemické ionizace za
atmosférického tlaku (APCI).
Druhá část práce byla věnována necílené metodě kvantifikace celých tříd lipidů
separovaných HILIC-HPLC/ESI-MS metodou při záznamu kladných iontů pomocí
jednoho interního standardu a odezvových faktorů daných tříd lipidů. Odezvové faktory
byly vypočteny z parametrů kalibračních závislostí interního standardu a standardů
jednotlivých tříd lipidů. Koncentrace dané třídy lipidů byla vypočtena jako součin plochy
píku v HILIC chromatogramu a odezvového faktoru dané třídy vztažené k internímu
standardu. Přesnost a správnost našich výsledků byla potvrzena srovnáním s běžně
používanou metodou kvantitativní analýzy s využitím skenu vybraných iontových reakcí
(SRM) pomocí trojitého kvadrupólu a také kvantifikací pomocí nukleární magnetické resonance. Možnost použití různých typů biologických vzorků byla testována na lidské
referentní plazmě a vaječném žloutku.
V poslední části práce byla provedena detailní charakterizace jednotlivých tříd
lipidů v orgánech prasete (mozek, srdce, ledvina, játra, plíce, mícha, slezina a žaludek)
pomocí naší necílené kvantitativní analýzy. Jednotlivé lipidy uvnitř těchto tříd byly
identifikovány pomocí relativních intenzit deprotonovaných molekul [M-H]- při záznamu
záporných iontů ESI spekter a pomocí off-line dvoudimenzionální HILIC x RPHPLC/
ESI-MS. Průměrné hodnoty počtu atomů uhlíku a počtu dvojných vazeb
analyzovaných orgánů prasete byly vypočteny na základě složení jednotlivých lipidů a
byly použity pro jejich charakterizaci. Složení mastných kyselin v orgánech prasete bylo
po transesterifikaci methanolátem sodným určeno pomocí plynové chromatografie s
plamenově-ionizační detekcí. |
cze |
| dc.format |
115 s.+ teze |
cze |
| dc.format.extent |
2600093 bytes |
cze |
| dc.format.mimetype |
application/pdf |
cze |
| dc.language.iso |
cze |
|
| dc.publisher |
Univerzita Pardubice |
cze |
| dc.rights |
Práce bude přístupná pouze v rámci univerzity od 31.1.2023 |
cze |
| dc.subject |
lipidomika |
cze |
| dc.subject |
lipidy |
cze |
| dc.subject |
fosfolipidy |
cze |
| dc.subject |
kapalinová chromatografie hydrofilních
interakcí |
cze |
| dc.subject |
kapalinová chromatografie v obrácených fázích |
cze |
| dc.subject |
dvoudimenzionální kapalinová
chromatografie |
cze |
| dc.subject |
hmotnostní spektrometrie |
cze |
| dc.subject |
kvantitativní analýza |
cze |
| dc.subject |
orgány prasete |
cze |
| dc.subject |
lipidomic |
eng |
| dc.subject |
lipids |
eng |
| dc.subject |
phospholipids |
eng |
| dc.subject |
hydrophilic interaction liquid chromatography |
eng |
| dc.subject |
reversed-phase liquid chromatography |
eng |
| dc.subject |
two-dimensional liquid chromatography |
eng |
| dc.subject |
mass
spectrometry |
eng |
| dc.subject |
quantitation |
eng |
| dc.subject |
porcine organs |
eng |
| dc.title |
Lipidomická analýza rostlinných a živočišných tkání technikou HPLC/MS |
cze |
| dc.title.alternative |
Lipidomic analysis of plant and animal tissues using HPLC/MS |
eng |
| dc.type |
disertační práce |
cze |
| dc.contributor.referee |
Cvačka, Josef |
cze |
| dc.contributor.referee |
Nováková, Lucie |
cze |
| dc.date.accepted |
2013 |
cze |
| dc.description.abstract-translated |
Lipids are important components in all biological tissues having many essential
roles associated with the proper function of the organism. The identification and
quantitation of a wide range of lipids in complex biological samples is an essential
requirement for the lipidomic studies. High-performance liquid chromatography ? mass
spectrometry coupling has the highest potential to obtain detailed information on the whole
lipidome, but the reliable identification and quantitation of multiple lipid classes is still a
challenging task due to the extreme sample complexity of lipids and their amphipathic
character.
Lipid extracts were separated using hydrophilic interaction liquid chromatography
(HILIC) into individual lipid classes in the first dimension. The HILIC separation
conditions were optimized to achieve the highest number of separated lipid classes. The
influence of column packing, mobile phase composition, separation temperature and
gradient steepness were tested to achieve the best chromatographic resolution. The crucial
influence of water contents in the mobile phase on the separation selectivity and
chromatographic resolution was observed. Optimized HILIC method enabled separate 16
lipid classes and 3 regioisomeric pairs in one analytical run. Individual lipid classes were
identified using electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). For the detailed
information, the fractions of lipid classes separated in the first dimension were manually
collected and further separated in the second dimension into individual lipid species using
reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). As for the HILIC
method, the special attention was paid to the optimization of chromatographic conditions
to achieve the highest number of separated species. ESI-MS was used for the identification
of polar lipid species, while atmospheric pressure chemical ionization (APCI) was prefered
for non-polar lipid species.
The second part of this work was devoted to the nontargeted quantitation of lipid
classes separated by HILIC-HPLC/ESI-MS method in the positive-ion mode using a single
internal standard and lipid class response factors. Response factors were calculated from
parameters of calibration curves measured for the internal standard and standards of
individual lipid classes. The concentration of lipid class was obtained by the peak area in
the HILIC chromatogram multiplied by RF related to the single internal standard. The
accuracy and precision of our results were confirmed by the comparison with established
selected reaction monitoring (SRM) quantitation approach on triple quadrupole mass spectrometer and also nuclear magnetic resonance quantitation. The applicability for
various types of biological samples was tested on human reference plasma and egg yolk.
In the last part of this work, the comprehensive lipidomic characterizations of
porcine organs (brain, heart, kidney, liver, lung, spinal cord, spleen and stomach) were
performed using our developed nontargeted quantitative method of lipid classes. Individual
lipid species inside these classes were determined based on relative abundances of
deprotonated molecules [M-H]- in the negative-ion ESI mode and off-line HILIC x RPHPLC/
ESI-MS. The average values of numbers of carbon atoms and double bonds of
analyzed porcine organs were calculated based on the lipid species composition and used
for their characterization. The fatty acid composition of porcine organs was determined by
gas chromatography with the flame ionization detection after the transesterification with
sodium methoxide. |
eng |
| dc.description.department |
Katedra analytické chemie |
cze |
| dc.thesis.degree-discipline |
Analytická chemie |
cze |
| dc.thesis.degree-name |
Ph.D. |
cze |
| dc.thesis.degree-grantor |
Univerzita Pardubice. Fakulta chemicko-technologická |
cze |
| dc.identifier.signature |
D27696 |
cze |
| dc.thesis.degree-program |
Analytická chemie |
cze |
| dc.description.defence |
Předseda komise představil dizertantku a seznámil přítomné s jejími základními životopisnými údaji. Vedoucí dizertační práce a vedoucí pracoviště přednesli svá doporučující vyjádření k obhajobě. Následovala prezentace dizertační práce dizertantkou. Dále oponenti přednesli své oponentní posudky a dizertantka se vyjádřila k jejich připomínkám a dotazům. Konstatováno, že zvenčí nepřišly žádné připomínky k práci. Následovala diskuse k práci:
- prof. Jandera: otázka kvantifikace lipidů, rozdíl mezi HILIC a silikagelovou stac. fází, otázka optimalizace
- doc. Cvačka: rozlišení hydroxylovaných a nehydroxylovaných mastných kyselin.
V neveřejné části obhajoby byla konstatována vysoká kvalita předložení dizertační práce.
Následovalo tajné hlasování. |
cze |
| dc.identifier.stag |
20523 |
cze |
| dc.description.grade |
Dokončená práce s úspěšnou obhajobou |
cze |
