Biosenzory založené na acetylcholinesterase pro stanovení pesticidů

Abstract

Diplomová práce byla zaměřena na přípravu funkčního elektrochemického biosenzoru na bázi acetylcholinesterasy (AChE), pomocí kterého by bylo možné stanovit organofosforové (OP), popřípadě karbamátové (CB), pesticidy. Navržený biosenzor reaguje na přítomnost organofosforofých nebo karbamátových pesticidů ve vzorku úbytkem aktivity biorekogničního elementu: acetylcholinesterasy. To se projeví nepřímoúměrně na množství přeměněného acetylthiocholinu na thiocholin, který se následně stanoví elektrochemicky. Pro konstrukci tohoto biosenzoru jsme použili standardní tříelektrodové amperometrické senzory vyrobené metodou sítotisku. Zvolili jsme vhodný elektrodový systém, způsob imobilizace AChE a optimální metodu detekce. Podařilo se nám optimalizovat některé z reakčních podmínek a vyhodnotit kinetické parametry enzymové reakce. Následně jsme zjistili i vhodné analytické parametry pro kalibrační roztoky modelových vzorků diisopropylfluorofosfátu (DFP) a paraoxon-ethylu. Jako vhodnou inkubační dobu pro tyto dva modelové vzorky jsme zvolili 30 minut. Mez detekce se pro oba řádově pohyboval v hodnotě 10-5 mol/l, pro paraoxon-ethyl byl však zhruba 5x vyšší. V rámci stanovení pesticidů v modelových vzorcích jsme zvážili i ovlivnění měření interferujícími látkami, které se běžně vyskytují v přírodních vzorcích. Jako kontrolní metodu výsledků jsme zvolili spektrofotometrické stanovení Ellmanovou metodou. Z acetylthiocholinchloridu (ATChCl) vzniká během enzymové reakce thiocholin, který dále reaguje s 5,5´-dithiobis-(2-nitrobenzoovou) kyselinou (DTNB) za vzniku žlutě zbarveného thionitrobenzoátu. Spektrofotometricky měříme minutovou změnu absorbance tohoto roztoku při 412 nm ihned po přidání DTNB. V přítomnosti inhibitorů AChE je tato reakce blokována.