Optimalizace enzymatického štěpení proteinů pro účely rychlé přípravy proteomických vzorků

Abstract

Při identifikaci proteinů je příprava proteolytických vzorků velmi důležitým krokem. Pro účely proteomické analýzy se preferuje štěpení bílkovin pomocí enzymů, protože enzymatická hydrolýza zaručuje vysokou specifitu a reprodukovatelnost. Nejčastěji používaným enzymem této fáze analýzy je trypsin. Trypsin katalyzuje hydrolýzu vazeb na C-konci aminokyselinového řetězce za argininem a lysinem. Výhodou použití trypsinu je vznik peptidů, které jsou svojí velikostí vhodné pro hmotnostní analýzu. Aby bylo možné analyzovaný protein identifikovat s dostatečnou přesností, je nutné získat peptidy s vysokým pokrytím aminokyselinové sekvence proteinu. Pro zajištění dostatečné efektivity proteolýzy je vyžadován čas 12-16 hodin. Cílem této diplomové práce byla optimalizace doby enzymatického štěpení za účelem urychlení přípravy proteomických vzorků. Jako faktor ovlivňující rychlost štěpení byla vybrána teplota a vysoký tlak. Jako standardní proteiny byly vybrány betagalaktosidasa a enolasa, enzymem byl zvolen trypsin a to v solubilní a imobilizované formě. Rozmezí teplot pro obě formy trypsinu byly stanoveny na základě pokusu, ve kterém byla porovnávána aktivita obou forem trypsinu při různých teplotách. Kvalitativní analýza byla provedena pomocí metody MALDI-TOF a QTOF, kvantitativní analýza pomocí metody QTRAP. Bylo zjištěno, že vysoká teplota nemá vliv na kvalitativní vyhodnocení analýzy, na rozdíl od štěpení vysokým tlakem, u kterého v krátkých časových intervalech byla zaznamenána vysoká kvalitativní výtěžnost. Nejvýznamnější vliv vysoké teploty byl zaznamenán při kvantitativním vyhodnocení, kdy bylo zjištěno, že štěpení solubilním trypsinem při teplotě 55°C poskytuje vyšší kvantitativní výtěžnost než štěpení klasickým způsobem při 37°C.