Detekce fragmentů DNA při poškození buněk

Brychtová, Věra

Publikace:
Detekce fragmentů DNA při poškození buněk

Diplomová práceopen access

dc.contributor.advisor	Roušar, Tomáš
dc.contributor.author	Brychtová, Věra
dc.contributor.referee	Handl, Jiří	cze
dc.date.accepted	2018-06-04
dc.date.accessioned	2018-06-14T06:03:56Z
dc.date.available	2018-06-14T06:03:56Z
dc.date.issued	2018
dc.date.submitted	2018-05-04
dc.description.abstract	Tato práce se zaměřuje na detailní popis procesu apoptózy a poskytuje teoretický přehled metod pro detekci apoptózy. Největší pozornost je věnována metodě TUNEL. V dnešní době patří TUNEL metoda mezi nejvíce používané metody pro detekci apoptózy. Cílem naší práce bylo optimalizovat použití TUNEL metody na vybrané buněčné linii, aplikovat optimalizovanou metodu na buněčné linii ovlivněné dvěma toxiny a na závěr práce použít komerční metodu TUNEL na stejné buněčné linii a porovnat ji s optimalizovanou metodou pomocí fluorescenční mikroskopie. V první části naší práce jsme optimalizovali jednotlivé kroky metodiky TUNEL na renální linii HK-2. Nejprve jsme se zaměřili na optimalizaci fixace buněk. Jako optimální jsme pro fixaci buněk vybrali použití 9,8% formaldehydu. Následně jsme prováděli permeabilizaci buněk Tritonem X-100 a jako nejvhodnější jsme určili použití 0,5% Tritonu X-100. V dalším kroku jsme optimalizovali inkorporaci bromdeoxyuridinu (BrdU) na zlomy DNA terminální deoxynukleotidyltransferázou a zhodnotili jsme, že nepříhodnější je použití BrdU (0,01 uM) a aplikace 4x ředěného enzymu. Dále jsme optimalizovali denaturaci DNA a blokování nespecifických míst, kdy jsme nalezli, že optimální je použití 2 M kyseliny chlorovodíkové a použití 1% hovězího sérového albuminu. V posledním kroku jsme optimalizovali navázání anti-BrdU protilátek na BrdU a jako nejvhodnější jsme vybrali ředění protilátek 1:2000. Při aplikaci optimalizované metody na HK-2 buňkách byl z fluorescenčních snímků patrný pozitivní signál fluorescence při ovlivnění buněk cisplatinou (25 uM, 50 uM) po době inkubace 16 a 20 hodin a kamptotecinem (2 uM, 10 uM) po době 24 a 48 hodin. Po použití komerční metody TUNEL na HK-2 buňkách ovlivněných cisplatinou (50 uM; 48 hodin) jsme z fluorescenčních snímků zhodnotili, že komerční metoda je senzitivnější než námi optimalizovaná metoda.	cze
dc.description.abstract-translated	This thesis is focused on a detailed description of the apoptosis process and provides an overview of methods for detection of apoptosis. The greatest attention has been paid to the TUNEL assay. Presently, TUNEL assay has been one of the most commonly used methods for detection of apoptosis. The aim of our thesis was to optimize the use of the TUNEL assay in a selected cell line, to apply the optimized method in the cell line treated with two toxins. Finally, we aimed to use the commercial TUNEL assay in the same cell line and to compare it with the optimized method. In our thesis, we optimized the individual steps of the TUNEL assay procedure in renal line HK-2. Firstly, we focused on optimizing cell fixation. As optimal, we chose 9.8% formaldehyde for cell fixation. Subsequently, we performed cell permeabilization by Triton X-100 and we chose the use of 0.5% Triton X-100 as optimal. In the next step, we optimized the incorporation of bromdeoxyuridine (BrdU) to DNA strand breaks using the terminal deoxynucleotidyl transferase. The most suitable application of BrdU was 0.01 uM and the application of TdT diluted four times. We also optimized DNA denaturation and blocking of nonspecific interaction. We found the use of 2 M hydrochloric acid and 1% bovine serum albumin as optimal. Finally, we optimized the binding of anti BrdU antibodies and we chose the 1: 2000 dilutions as the most suitable. When using the optimized method in HK-2 cells, the fluorescence positive signal was visible for cells treated with cisplatin (25 uM, 50 uM) for 16 and 20 hours and cells treated with camptothecin (2 uM, 10 uM) for 24 and 48 hours. Finally, after use of commercial TUNEL assay in HK-2 cells treated with cisplatin (50 uM; 48 hours), we found that the commercial method is much more sensitive than the optimized method.	eng
dc.description.defence	Prezentace výsledků diplomové práce. Diskuze k posudku vedoucího a oponenta diplomové práce. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP.	cze
dc.description.department	Fakulta chemicko-technologická	cze
dc.description.grade	Dokončená práce s úspěšnou obhajobou	cze
dc.format	77 s.
dc.identifier	Univerzitní knihovna ( studovna)	cze
dc.identifier.signature	D37704
dc.identifier.stag	35204
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/10195/70782
dc.language.iso	cze
dc.publisher	Univerzita Pardubice	cze
dc.rights	Bez omezení
dc.subject	apoptóza	cze
dc.subject	fragmentace DNA	cze
dc.subject	bromdeoxyuridin	cze
dc.subject	terminální deoxynukleotidyltranseferáza	cze
dc.subject	fluorescence.	cze
dc.subject	apoptosis	eng
dc.subject	DNA fragmentation	eng
dc.subject	bromdeoxyuridine	eng
dc.subject	terminal deoxynucleotidyl transferase	eng
dc.subject	fluorescence.	eng
dc.thesis.degree-discipline	Bioanalytik	cze
dc.thesis.degree-grantor	Univerzita Pardubice. Fakulta chemicko-technologická	cze
dc.thesis.degree-name	Mgr.
dc.thesis.degree-program	Speciální chemicko-biologické obory	cze
dc.title	Detekce fragmentů DNA při poškození buněk	cze
dc.title.alternative	Detection of DNA fragmentation after cell damage	eng
dc.type	diplomová práce	cze
dspace.entity.type	Publication