Využití HPLC/ED k monitorování některých klinicky významných sirných sloučenin

Abstract

Cílem této práce bylo (a) vyvinout vhodnou metodu pro stanovení endogenních hladin kyseliny lipoové, (b) ověřit, zda je tato metoda vhodná i pro stanovení hladin kyseliny lipoové po suplementaci, (c) určit cytotoxicitu kyseliny lipoové na erytrocyty, (d) ověřit význam homocysteinu jako biomarkeru v klinické praxi, získat obecný přehled o celkovém metabolismu methioninu u pacientů s onemocněním koronárních arterii a ověřit okamžitý vliv perkutánní koronární intervence na hladiny methioninu a jeho metabolitů. (a) Cílem bylo vyvinout vhodnou metodu pro stanovení hladin volné kyseliny lipoové. Jedná se o vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s elektrochemickou detekcí. Vzorky krve byly získány od 40 dobrovolných darců, kteří splňovali podmínky pro zapsání do registru dárců. Tito dárci nebyli suplementováni kyselinou lipoovou. Při stanovení kyseliny lipoové v plasmě byly vzorky krve odstředěny a získaná plasma byla deproteinována acetonitrilem. Po odstředění následovala extrakce na pevné fázi a kyselina lipoová byla eluována z kolonky methanolem. Eluát byl odpařen do sucha v atmosféře dusíku. Odparek byl rozpuštěn ve směsi acetonitrilu a deionizované vody, po filtraci byl vzorek dávkován na analytickou kolonu s vázanou reverzní fází. Limit detekce a kvantifikace této metody byl 1,85 a 5,18 nmol/l. Dosáhli jsme nižší hodnoty meze detekce v porovnání s předchozími studiemi (2,4 a 4,9 nmol/l), které se zabývaly stanovením volné kyseliny lipoové u nesuplementovaných jedinců. Nicméně. i přesto jsme hladiny kyseliny lipoové v plasmě u všech 40 dobrovolných dárců nedetekovali. Výsledky naší studie ukazuji, že endogenní koncentrace volné kyseliny lipoové v plasmě jsou pravděpodobně nižší než 1,85 nmol/l. (b) Tato metoda byla využita k ověření hladin kyseliny lipoové v plasmě. u suplementovaných dobrovolných dárců a je tak vhodná pro studie zabývající se stanovením hladin kyseliny lipoové u suplementovaných pacientů. (c) Byl sledován vliv kyseliny lipoové na životaschopnost (viabilitu) erytrocytů. Vzorky krve byly získány od dobrovolných nesuplementovaných dárců. Krev byla odstředěna při 750 x g, separované erytrocyty byly celkem 3x promyty fosfátovým pufrem, následně naředěny Ringerovým roztokem a dávkovány do 12jamkových kultivačních destiček. K suspenzi erytrocytů byly přidány různě naředěné roztoky kyseliny lipoové. Inkubace probíhala 24 a 48 hodin při 37 °C. K stanoveni viability buněk byla použita metoda vylučovaní trypanové modři. Námi testované koncentrace kyseliny lipoové (1, 5 a 10 μmol/l) nezpůsobily ani po 48hodinové inkubaci statisticky významné změny ve viabilitě ani počtu erytrocytů oproti kontrole. Také žádná z testovaných vysokých koncentrací (50, 100, 250 μmol/l) kyseliny lipoové nezpůsobila statisticky významné změny ve viabilitě erytrocytů. Na počet erytrocytů měly vysoké koncentrace statisticky významný vliv již po 24hodinové inkubaci. (d) Hladiny celkového homocysteinu, cysteinu, methioninu a cysteinyl-glycinu v plasmě byly stanoveny metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s coulometrickou detekci. Důvodem byla rychlá příprava vzorku bez nutnosti derivatizace a nižší finanční nároky oproti jiným metodám. Vzorky krve byly získány od 68 pacientů s prokázaným onemocněním koronárních artérii, kteří byli rozděleni do tří skupin dle stupně závažnosti onemocnění. Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v prevalenci diabetu, pre-diabetu a onemocnění ledvin mezi sledovanými skupinami, rovněž mezi kuřáky, nekuřáky i pacienty s normálním a zvýšeným krevním tlakem. Byly zjištěny signifikantní rozdíly v hladinách albuminu, celkového cholesterolu, LDL-cholesterolu a stupně indexu aterogenity u sledovaných skupin pacientů. Byly zjištěny statisticky významně zvýšené hladiny homocysteinu u pacientů s akutní formou onemocnění v porovnání s pacienty trpící chronickou formou tohoto onemocnění. Naše výsledky podporují hypotézu, že homocystein nelze využít pro včasnou diagnostiku stenózy v koronárních arteriích, ale zdá se, že by mohl být dobrým biomarkerem závažnosti již prokázaného onemocnění koronárních artérií. Zvýšené hladiny homocysteinu korelují s nestabilitou onemocnění a nutností léčby. U pacientů, u nichž došlo k dokončení revaskularizace, statisticky významně poklesly hladiny cysteinu, cysteinyl-glycinu a methioninu před druhou intervencí v porovnání s pacienty mající akutní a chronickou formu onemocnění. Tento stav je pravděpodobně spojen se zvýšeným oxidačním stresem, kdy je preferována transsulfurační dráha, která zvyšuje spotřebu cysteinu. Zdá se tedy, že cystein hraje důležitou úlohu v organismu jako antioxidant než jako rizikový faktor u pacientů s onemocněním koronárních artérií. Z této skupiny pacientů bylo vybráno 44 pacientů, u kterých následovala po angiografii perkutánní koronární intervence. Vzorky krve byly odebírány ve třech časových bodech, před zákrokem, 24 a 48 hodin po intervenci. Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v hladinách homocysteinu a cysteinu před zákrokem, 24 a 48 hodin po zákroku. Hladiny methioninu a cysteinyl-glycinu byly signifikantně vyšší 24 a 48 hodinách po intervenci ve srovnání s hladinami před zákrokem.