Stanovení oxokyselin odvozených od aminokyselin s rozvětveným řetězcem pomocí HPLC s fluorimetrickou detekcí

Abstract

Oxokyseliny s rozvětveným řetězcem (ketoisovalerát, ketoisokaproát, ketomethylvalerát) jsou prvními produkty metabolismu při odbourávání aminokyselin s rozvětveným řetězcem. Vysoké hladiny oxokyselin s rozvětveným řetězcem v plazmě a krvi můžou způsobit nemoc javorového sirupu. Byla vyvinuta HPLC metoda s fluorescenční detekcí pro stanovení oxokyselin s rozvětveným řetězcem v plazmě a suchých krevních skvrnách. Oxokyseliny byly derivatizovány s o fenylendiaminem. Pro separaci derivátů byla použita chromatografická kolona LiChroCart 125-4 Purospher RP-18e, 5 ?m. Eluce byla provedena v gradientovém módu, kde jako mobilní fáze A byla použita směs methanolu s deionizovanou vodou (55:45, v/v pro plazmu a 50:50, v/v pro suché krevní skvrny) a mobilní fáze B obsahovala 100% methanol. Analytické parametry prezentované metody byly následující: přesnost v sérii, vyjádřená variačním koeficientem, byla v suchých krevních skvnách 3,67% pro KIV, 3,58% pro KIC a 3,18% pro KMV. Kalibrační křivka byla lineární v testovaném rozsahu koncentrací. Správnost vyjádřená výtěžností metody pro suché krevní skvrny KIV, KIC a KMV byla následující: 104,98% (CV 1,79%), 104,00% (CV 3,59%) a 101,99% (CV 4,85%). Vyvinuli jsme jednoduchou a selektivní HPLC metodu s fluorescenční detekcí pro stanovení oxokyselin v suchých krevních skvrnách a v plazmě.