Využití purifikovaných toxických látek při studiu nefrotoxicity In vitro

Abstract

Acetaminofen (paracetamol, APAP) je v naší i světové populaci jedním z nejužívanějších analgetik a antipyretik. V ČR je registrováno přibližně 250 volně prodejných léků obsahujících tuto účinnou látku. Díky tomu každoročně narůstá riziko jeho předávkování, které může vést až k akutnímu poškození ledvin. Cílem této práce proto bylo charakterizovat nefrotoxické působení APAP a jeho konjugátů in vitro a vyvrátit či potvrdit námi uvažovanou hypotézu o možné roli APAP konjugátů v acetaminofenové nefrotoxicitě. Dále jsme se zaměřili na možné využití detekce extracelulární koncentrace neutrofilního s gelatinasou asociovaného lipokalinu (Hall et al.) při hodnocení akutní in vitro nefrotoxicity. Všechny experimenty byly testovány na lidských imortalizovaných proximálních tubulárních buňkách (HK-2 linie). K testování APAP nefrotoxicity jsme de novo organickou syntézou připravili glutathionový (APAP-SG) a cysteinový (APAP-Cys) konjugát acetaminofenu, u kterých byla po jejich purifikaci ověřena jejich struktura a čistota (> 98 %). U testování NGAL produkce byly k indukci nefrotoxicity použity různorodé chemické sloučeniny (APAP, terc-butylovaný hydroperoxid, cisplatina, HgCl2, CdCl2 a gentamicin). Charakterizací APAP nefrotoxicity jsme zjistili, že samotný APAP způsobuje na dávce a délce inkubace závislé poškození buněk, které je asociováno s produkcí reaktivních kyslíkových sloučenin (ROS), nikoli ale s poklesem intracelulární koncentrace glutathionu (GSH). Významný toxický vliv jsme nalezli také u APAP-SG a APAP-Cys, přičemž u APAP-SG jsme pozorovali zvýšenou tvorbu ROS spojenou s deplecí GSH. Při hodnocení nefrotoxicity HK-2 buněk pomocí NGAL jsme překvapivě zjistili, že míra toxického poškození buněk negativně koreluje s poklesem extracelulární produkce NGAL. Námi nalezené výsledky potvrzují náš předpoklad o významné roli APAP konjugátů v acetaminofenové nefrotoxicitě a zcela vyvrací obecně přijímanou skutečnost o jejich netoxickém vlivu. U hodnocení nefrotoxicity pomocí extracelulární produkce NGAL jsme popsali zajímavý vztah mezi nefrotoxicitou nalezenou pomocí běžných cytotoxických testů a jeho koncentrací.