Spektrofluorimetrické stanovení oxidované formy glutathionu

Abstract

Glutathion (gama-glutamylcysteinylglycin) je nízkomolekulární thiol vyskytující se v buňce v koncentraci 0,1-10 mmol/l, a je tak nejhojnějším intracelulárním thiolem. Díky své jedinečné struktuře je glutathion spojený s mnoha důležitými pochody. Působí jako antioxidant a chrání tak buňky před působením volných radikálů a reaktivních sloučenin. Dále hraje významnou roli při detoxikaci potenciálně škodlivých xenobiotik. Glutathion se vyskytuje v redukované (GSH), nebo oxidované formě (GSSG). Za fyziologických podmínek je více než 99 % glutathionu v buňce ve formě GSH. Zvýšená koncentrace GSSG se vyskytuje při oxidačním stresu, se kterým jsou spojena onemocnění, jako je rakovina, neurodegenerativní choroby, kardiovaskulární choroby, aj. Je tedy důležité najít optimální metodu, která přesně a spolehlivě stanoví množství glutathionu. Nejvíce rozšířenými jsou HPLC metody. Jejich velkou výhodou je vysoká specifita, citlivost a reprodukovatelnost. Hlavní nevýhodou je vysoká časová náročnost, a tím nemožnost měření velkého množství vzorků během krátké doby. Další nevýhodou metod HPLC jsou vysoké náklady. Cílem této práce bylo zavedení a optimalizace nové spektrofluorimetrické metody pro stanovení GSSG, jejímž základem je stanovení fluoreskujícího produktu, který vzniká reakcí glutathionu s o ftalaldehydem. Po optimalizaci vlnových délek ( EX = 335 nm, EM = 420 nm), hodnoty pH (pH 6) a teploty (T = 4 °C), byly zjištěny tyto parametry analýzy: pro kalibraci s linearitou 0 100 mol/l GSSG, R2 = 0,9999; intraassay (n = 10), CV(%) = 3,43 %; interassay (n = 10), CV(%) = 8,17 %; REC(%) = 100,95 % a hodnota detekčního limitu 0,30 mol/l GSSG. Korelační koeficient získaný porovnáním hodnot koncentrací vzorků s HPLC/FL byl stanoven r = 0,993. Můžeme tedy říci, že byla zavedena spolehlivá, citlivá a přesná metoda pro stanovení GSSG, jejíž velkou výhodou oproti HPLC je vysoká rychlost analýzy a nízká cenová náročnost.