Stanovení aktivity laktátdehydrogenasy jako markeru cytotoxicity

Abstract

Laktátdehydrogenáza (LDH) je důležitý cytoplasmatický enzym, který zodpovídá za reverzibilní přeměnu pyruvátu na laktát. LDH je přítomna prakticky ve všech buňkách těla a do krevního oběhu se může uvolňovat již při malém tkáňovém poškození. Strukturně je molekula LDH tvořena dvěma podjednotkami. Vzájemnou kombinací těchto podjednotek vzniká 5 izoenzymů laktátdehydrogenázy. Nejčastější metodou stanovení LDH je spektrofotometrické stanovení, kdy měříme pokles absorbance LDH při 340 nm. Tento pokles je způsobený oxidací NADH a je přímo úměrný aktivitě laktátdehydrogenázy ve vzorku. Naším cílem bylo zavést stanovení LDH pomocí komerční sady a vedle toho optimalizovat vlastní postup pro stanovení aktivity tohoto enzymu. Při optimalizaci jsme testovali vliv přítomnosti draselno-fosfátového, sodno-fosfátového pufru a TRIS pufru na aktivitu LDH detekovanou ve vzorcích. Ke stanovování aktivity LDH v biologickém materiálu jsme využili homogenát potkaních jater, kde jsme porovnávali naměřené hodnoty námi optimalizovanou metodou s výsledky získanými pomocí komerční sady. Dále jsme se v této diplomové práci věnovali vlivu teploty na aktivitu LDH při skladování vzorku na ledu, při pokojové teplotě a v mrazáku. V poslední části práce jsme sledovali změnu aktivity LDH v médiu u ledinných HK-2 buněk po jejich inkubaci s acetaminofenem. Na základě získaných poznatků shrnujeme, že jsme zavedli novou metodu stanovení aktivity LDH, která je například vhodná pro charakterizaci poškození buněk a je srovnatelná s komerčně dodávanou sadou.