Příprava specifického imunosorbentu pro průkaz Aβ peptidů, markerů Alzheimerovy choroby

Abstract

Cílem diplomové práce byla příprava specifického imonosorbentu a optimalizace podmínek pro izolaci, průkaz a detekci Aβ peptidů, markerů Alzheimerovy choroby. Koncentrace Aβ peptidů různých délek řetězců přímo koreluje s tvorbou amyloidových plátů, jejichž kumulace je sledována při progresi onemocnění a postupném zhoršování kognitivních funkcí nemocných. Pro optimalizaci podmínek izolace byl vybrán modelový systém křenová peroxidasa (Horseradish Peroxidase-HRP) a anti-HRP (polyklonální protilátky proti HRP). Zkoumána byla vazba protilátek na makroporézní nosič perlové celulózy, podmínky vazby a eluce antigenu na imunosorbent a zároveň optimální molární poměr mezi antigenem a protilátkou vedoucí k tvorbě imunokomplexu. K posouzení vlivu prostředí na tvorbu imunokomplexu byly použity techniky imunoturbidimetrie a ELISA test, získané informace byly aplikovány v kolonovém uspořádání metodou nízkotlaké kapalinové chromatografie. Z důvodu optimalizace vazebných a elučních podmínek byla na připravených imunosorbentech pro izolaci A? peptidů provedena řada srovnání. U použitých magnetických nosičů s různými funkčními skupinami byla porovnána účinnost vazby protilátek. K určení množství navázaných protilátek bylo použito několik způsobů: srovnání absorbance vazebného roztoku protilátek před a po imobilizací, stanovení množství protilátek ve vazebných frakcích pomocí BCA testu respektive kontrola množství protilátek technikou SDS-PAGE. Jako nejvhodnější nosič k izolaci A? peptidů byl vybrán SiMAG-hydrazide, na který byly imobilizovány králičí anti-A? IgG specificky orientované na aminokyselinový úsek 1-14 lidského A? peptidu. S připraveným imunosorbentem byly provedeny izolace A? peptidů, množství izolovaných A? peptidů bylo kvantifikováno technikami Tricine-SDS-PAGE a ELISA testem.