Vizualizace biofilmu a možnosti využití této techniky pro jeho průkaz a sledování interakcí mezi klinicky významnými mikroorganizmy

Abstract

Předložená diplomová práce byla zaměřena na vizualizaci tvorby mikrobiálního biofilmu s hodnocením vztahů mezi jednotlivými testovanými kmeny mikroorganizmů a na možnosti biologického ovlivnění produkce biofilmu. Do testů bylo zařazeno 305 kmenů bakterií a 104 kmenů kvasinek. Pomocí Christensenovy metody byla produkce biofilmu u bakterií prokázána u 101 kmenů (33,1%), kdy z tohoto množství bylo 12 kmenů (11,9%) označeno jako hyperproducenti. U kvasinek bylo biofilm pozitivních kmenů 24 (23,1%), z toho hyperprodukující 3 (12,5%) kmeny. Vybrané kmeny byly pro vizualizaci biofilmu testovány v různých modifikacích technikou růstu na úzkém podložním mikroskopickém skle, které bylo ponořeno do suspenze kultury v Sabouraudově tekutém médiu s 8% glukózy v plastové zkumavce. Ukončení testu bylo prováděno sušením a fixací preparátu metylalkoholem a následným barvením dle Grama. Diferenciace preparátů byla prováděna světelným mikroskopem při zvětšení 630 ? 1000x. Vztahy mezi jednotlivými mikroorganizmy byly testovány popsanou sklíčkovou technikou a také pomocí Christensenovy metody v mikrotitračních destičkách za použití stejného kultivačního média. Biofilm pozitivní kmeny vytvářely na mikroskopickém skle mnohobuněčná hnízda ? mikrokolonie spojené mezi sebou úzkými můstky do podoby nepravidelné sítě, kterou jsme v našem testu hodnotili jako zcela běžnou formu produkce biofilmu. Při hodnocení směsných kultur mikroorganizmů jsme pozorovali koagregaci použitých kmenů pouze v systému kvasinka + některá Gram negativní tyčinka. Žádný zjevný posun ve vizualizaci nepřineslo ani prodloužení inkubační doby až na 120 hodin. Pro sledování biologického ovlivnění produkce a charakteru biofilmu bylo použito biopreparátu obsahujícího živou kulturu mikromycety Pythium oligandrum. Tyto testy probíhaly také jako sklíčkové kultury a jako testy v mikrotitrační destičce. Mikroskopická vizualizace přinesla informace pouze o snížené aktivitě tvorby biofilmu v systému s P. oligandrum, nebylo ji však možné blíže kvantifikovat. Při použití mikrotitračních destiček byly získané výsledky více průkaznější. Bylo zjištěno, že s rostoucí délkou expozice biofilmu, či biofilm pozitivního mikroorganizmu s P. oligandrum stoupá procento významného poklesu produkce biofilmu. Je tedy možné předpokládat, že použití P. oligandrum může významně ovlivnit virulenci některých mikroorganizmů. Tento fenomén zjištěný in vitro však bude pro medicínské využití vyžadovat další testy a ověření. Zklamáním pro nás bylo zjištění, že technika barvení dle Grama je vhodná pouze pro základní vizualizaci ? průkaz tvorby biofilmu, ale není příliš vhodná pro studium struktury biofilmu a vztahů mezi přítomnými mikroorganizmy.