Optimalizace podmínek kultivace potkaních hepatocytů in vitro

Abstract

Buněčné kultury izolovaných hepatocytů patří v dnešní době mezi nejpoužívanější biologické modely in vitro. Jsou používány při studiu buněčných mechanizmů specifických pro jaterní buňky, studiu jaterních onemocnění, hepatotoxicity a metabolizmu. Cílem práce bylo nejprve provést optimalizaci metod pro zjištění viability buněk kultivovaných na vícejamkových destičkách: stanovení aktivity laktátdehydrogenázy (LDH) a testu WST-1. Dalším cílem bylo pomocí těchto optimalizovaných metod popsat vliv změny kultivačních podmínek (denzita buněk, objem kultivačního média, doba seedingu) na viabilitu buněk, a to u intaktních buněk a u buněk inkubovaných s modelovou hepatotoxickou látkou - tBHP. Ze získaných dat byly určeny optimální podmínky stanovení WST-1 (37 °C; 1 hod.) a LDH (37 °C; 30 000 bb/j). Za těchto podmínek byl nejprve sledován vliv objemu kultivačního média na viabilitu buněk testem WST-1. Ze získaných hodnot bylo zjištěno, že objem média statisticky významně ovlivňuje viabilitu buněk - s rostoucím objemem se viabilita zvyšuje. Dále byl sledován vliv doby seadingu na viabilitu hepatocytů pomocí testu WST-1. Z výsledků vyplývá, že s rostoucí dobou seedingu se viabilita hepatocytů výrazně zvyšuje. U hepatocytů, které byly inkubovány s tBHP, byl vliv objemu média na viabilitu nejprve testován pomocí WST-1. Viabilita hepatocytů se snižovala s rostoucí koncentrací tBHP, rozdíl ve viabilitě mezi buňkami inkubovanými v 100 a 150 ?l (média a tBHP) ale nebyl statisticky významný. Působení tBHP bylo sledováno také pomocí stanovení intra- a extracelulární aktivity LDH, popř. LDHleakage. U extracelulární aktivity LDH a LDH-L byla prokázána toxicita tBHP vyšší u buněk inkubovaných ve 100 ?l v porovnání s buňkami inkubovanými ve 150 ?l. U intracelulární aktivity LDH nebyl ve viabilitě buněk nalezen žádný rozdíl.