Glutathionreduktasa - stanovení aktivity a možnosti její modulace

Abstract

Glutathionreduktasa (GR) je řazena do skupiny dimerických flavoenzymů, které katalyzují přenos elektronů díky přítomnosti flavinadenindinukleotidu ve své struktuře. Skládá se ze dvou identických podjednotek, na kterých jsou umístěna vazebná místa pro NADPH a také pro GSSG. Hlavní funkcí tohoto enzymu je NADPH-dependentní redukce oxidované formy glutathionu (GSSG) na formu redukovanou (GSH). Aktivita glutathionreduktasy je nejčastěji stanovována spektrofotometrickou metodou, která je založena na měření poklesu absorbance způsobené oxidací NADPH při 340 nm. Rychlost poklesu absorbance je přímo úměrná aktivitě GR. Při tomto stanovení se využívají dva substráty - GSSG a NADPH. Cílem naší práce bylo otestovat vliv různých parametrů metodiky (teplota, pH, stabilita) na stanovení aktivity glutathionreduktasy u purifikované kvasinkové GR a zjistit optimální podmínky stanovení. Pro stanovení aktivity glutathionreduktasy jsme jako optimální pufr určili draselný fosfátový pufr (pH 7,4). Testovali jsme také závislost koncentrace GSSG a NADPH na aktivitě GR, kdy jako optimální koncentrace byly zvoleny 10 mM GSSG a 1,6 mM NADPH. Zjistili jsme, že GR je stabilní po dobu nejméně dvou hodin při laboratorní teplotě (21 °C). P ři dlouhodobém zamražení (-20 °C) a zárove ň opakovaným zamražením/rozmražením došlo k poklesu aktivity. Dále jsme sledovali možný inhibiční vliv některých komerčně dostupných látek (ethakrynová kyselina, N-ethylmaleimid, diethylmaleát, glutathion) na aktivitu GR. V přítomnosti N-ethylmaleimidu překvapivě nedošlo k poklesu aktivity GR. Pouze u ethakrynové kyseliny a glutathionu byla inhibice prokázána. Při použití 500 mM koncentrace ethakrynové kyseliny byla zjištěna téměř 20% inhibice aktivity. Zjistili jsme také, že v přítomnosti 10 mM GSH, což je koncentrace vyskytující se běžně v buňce, došlo k poklesu glutathionreduktasové aktivity o 60 %.