Lipidomická analýza rostlinných a živočišných tkání technikou HPLC/MS

Abstract

Lipidy jsou důležitou složkou všech biologických tkání s řadou důležitých rolí souvisejících se správnou funkcí organismu. Základním požadavkem lipidomických studií je identifikace a kvantifikace velkého množství lipidů ve složitých biologických vzorcích. Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií má velký potenciál získat detailní informace o celém lipidomu, ale spolehlivá identifikace a kvantifikace všech tříd lipidů je stále náročný úkol kvůli velké komplexitě vzorků lipidů a jejich amfipatickému charakteru. V první dimenzi byl celkový extrakt lipidů separován pomocí kapalinové chromatografie hydrofilních interakcí (HILIC) na jednotlivé třídy lipidů. Podmínky HILIC separace byly optimalizovány za účelem dosáhnout co největšího počtu separovaných tříd lipidů. Byl testován vliv náplně kolony, složení mobilní fáze, teploty kolony a sklonu gradientu na účinnost separace. Bylo zjištěno, že množství vody v mobilní fázi má zásadní vliv na selektivitu a účinnost separace. Optimalizovaná HILIC metoda umožnila separaci 16 tříd lipidů a 3 regioisomerních párů v jedné analýze. Jednotlivé třídy lipidů byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem (ESI-MS). Pro získání detailních informací byly frakce separovaných tříd lipidů v první dimenzi preparativně izolovány a separovány v druhé dimenzi pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie v systémech s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na jednotlivé lipidy. Stejně jako pro HILIC separaci, zvláštní pozornost byla věnována optimalizaci podmínek za účelem dosažení maximálního počtu separovaných lipidů. Jednotlivé polární lipidy byly identifikovány pomocí ESI-MS, zatímco nepolární lipidy pomocí chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI). Druhá část práce byla věnována necílené metodě kvantifikace celých tříd lipidů separovaných HILIC-HPLC/ESI-MS metodou při záznamu kladných iontů pomocí jednoho interního standardu a odezvových faktorů daných tříd lipidů. Odezvové faktory byly vypočteny z parametrů kalibračních závislostí interního standardu a standardů jednotlivých tříd lipidů. Koncentrace dané třídy lipidů byla vypočtena jako součin plochy píku v HILIC chromatogramu a odezvového faktoru dané třídy vztažené k internímu standardu. Přesnost a správnost našich výsledků byla potvrzena srovnáním s běžně používanou metodou kvantitativní analýzy s využitím skenu vybraných iontových reakcí (SRM) pomocí trojitého kvadrupólu a také kvantifikací pomocí nukleární magnetické resonance. Možnost použití různých typů biologických vzorků byla testována na lidské referentní plazmě a vaječném žloutku. V poslední části práce byla provedena detailní charakterizace jednotlivých tříd lipidů v orgánech prasete (mozek, srdce, ledvina, játra, plíce, mícha, slezina a žaludek) pomocí naší necílené kvantitativní analýzy. Jednotlivé lipidy uvnitř těchto tříd byly identifikovány pomocí relativních intenzit deprotonovaných molekul [M-H]- při záznamu záporných iontů ESI spekter a pomocí off-line dvoudimenzionální HILIC x RPHPLC/ ESI-MS. Průměrné hodnoty počtu atomů uhlíku a počtu dvojných vazeb analyzovaných orgánů prasete byly vypočteny na základě složení jednotlivých lipidů a byly použity pro jejich charakterizaci. Složení mastných kyselin v orgánech prasete bylo po transesterifikaci methanolátem sodným určeno pomocí plynové chromatografie s plamenově-ionizační detekcí.