Vývoj bioaktivních nosičů pro pokročilou diagnostiku Alzheimerovy choroby

Abstract

V diplomové práci jsme ověřovali účinnost vazby nespecifického IgG izolované z lidského séra, specifických polyklonálních anti-ovalbuminových protilátek na SiMAG/PGL a SiMAG-IDA/Co3+ mikročástice. Získané poznatky jsme uplatnili při imobilizaci monoklonálních specifických protilátek proti Abeta peptidům (38 - 42 aminokyselin) a lidskému tau proteinu na SiMAG/PGL a SiMAG-IDA/Co3+ mikročástice. Účinnost vazby jsme hodnotili metodou SDS-PAGE. Zároveň jsme také hledali optimální podmínky pro imobilizaci protilátek na vybrané nosiče, tj. doba a teplota imobilizace. Ověřovali jsme také vliv stáří protilátky na vazbu na mikročástice. U nespecifického IgG jsme ověřovali čistotu a molekulovou hmotnost deklarovanou výrobcem. U specifických polyklonálních a monoklonálních protilátek jsme účinnost vazby na mikročástice ověřovali také izolací antigenu pomocí připravených imunosorbentů a jeho následného uvolnění z vazby kyselou elucí. Kontrolu úspěšnosti izolace jsme prováděli pomocí metod SDS-PAGE a Tris/tricin Urea SDS-PAGE. Na vybrané nosiče SiMAG/PGL a SiMAG-IDA/Co3+ jsme imobilizovali také kinázy, které hrají významnou roli v patogenezi Alzheimerovy choroby, kinázu GSK-3 (GSK-3beta His Tag) a MAP kinázu. Aktivitu vázaných kináz jsme ověřovali fosforylací nízkomolekulárních substrátů specifických pro dané kinázy. Ověřovali jsme nový substrát pro GSK-3, neboť standardně používaný CREB peptid se již nevyrábí. Detekci fosforylace jsme prováděli MS analýzou MALDI/TOF/TOF. Kinázu GSK-3 a MAP kinázu jsme použili pro fosforylaci lidského tau proteinu. Nejprve jsme tau protein fosforylovali solubilní MAP kinázou a následně solubilní a vázanou GSK-3 (GSK-3beta His Tag). Ve výsledných MS spektrech jsme sledovali moţná fosforylační místa tau proteinu.