Význam regulací signální cesty proteinu p53 v protinádorové léčbě: inhibice ATM

Abstract

Cílem této práce bylo sledování apoptózy a molekulárních změn vyvolaných mitoxantronem a mitoxantronem v kombinaci s kofeinem u lidských nádorových buněk. Jako modelový systém byla zvolena buněčná linie MOLT-4, odvozená od lidské T-lymfocytární leukémie. Nejprve jsme sledovali proliferační aktivitu buněk MOLT-4 po vystavení různým dávkám mitoxantronu a následně jsme sledovali proliferační aktivitu buněk vystavených působení mitoxantronu společně s kofeinem, jakožto inhibitorem ATM kinázy. Podrobnější analýzu ovlivněných buněk jsme provedli pomocí flow-cytometrie. Využívali jsme hodnocení buněčného cyklu pomocí obsahu DNA v buňce a hodnocení apoptózy pomocí duálního značení za použití Annexinu V a propidium jodidu. Dále jsme využívali změn optických parametrů rozptylu světla. Zjistili jsme, že kofein ruší blok v G2 fázi buněčného cyklu a v kombinaci s 0,5 nmol/l mitoxantronem má na buňky protektivní vliv, pozorovatelný zejména po 72 hodinách od ovlivnění. Následně jsme studovali změnu v množství proteinů důležitých při reparaci buňky a regulaci buněčného cyklu po působení cytostatika a inhibitoru ATM kinázy. Zabývali jsme se analýzou proteinu p53 a jeho fosforylovaných forem p53_ser15 a p53_ser392, dále jsme sledovali změnu v množství proteinu p21, ERK1/2 a štěpení laminu B. Pro kontrolu nanášky jsme používali stanovení aktinu. Tyto změny jsme detekovali pomocí elektroforézy následované western blotem zakončeným imunodetekcí. V této práci jsme potvrdili, že kofein zabraňuje fosforylaci proteinu p53 u buněk MOLT-4 a tím snižuje jeho stabilitu. Teoretická část této diplomové práce charakterizuje apoptózu, mechanizmy jejího spuštění a regulace a dále pak regulaci buněčného cyklu zejména na molekulární úrovni. Jsou popsány reparační procesy vyvolané aktivací ATM kinázy po poškození DNA. Popsáno je také působení mitoxantronu a kofeinu a nejsou opomenuty ani metody detekce apoptózy ať už pomocí průtokové cytometrie nebo western blot analýzy.