Optimalizace podmínek purifikace enzymů z biologického materiálu

Abstract

Glutathionreduktáza (GR) je enzym patřící do třídy oxidoreduktáz. Uplatnění nachází při přeměně oxidované formy glutathionu na redukovanou. Glutathion se v organizmu podílí na celé řadě fyziologických a metabolických funkcí. Glutathion především chrání organizmus před oxidačním stresem. Dále pak udržuje vitamíny v redukované formě, podílí se na detoxikaci xenobiotikých látek a transportu aminokyselin přes buněčnou membránu, a udržuje redukční prostředí v erytrocytech. Nejčastěji využívanými metodami při purifikaci glutathionreduktázy jsou v současnosti precipitace síranem amonným, dialýza a afinitní chromatografie. Cílem naší práce bylo optimalizovat jednotlivé kroky purifikace a jejich parametry, abychom zkrátili čas purifikace a zvýšili její účinnost. Testovali jsme optimální koncentraci síranu amonného při precipitaci standardu glutathionreduktázy a následně jsme tento pokus opakovali s lidskou krví. V případě precipitace standardu jsme určili jako optimální pro precipitaci glutathionreduktázy rozmezí saturace síranu amonného 50 % až 80 %. Poté jsme testovali optimální saturaci síranu amonného pro precipitaci GR na vzorku se složitější matricí (lyzovaných lidských erytrocytech). V tomto případě byla nalezená optimální saturace v rozmezí 4060 %. Při tomto pokusu bylo zjištěno, že při saturaci 50-60 % síranu amonného precipituje z roztoku lyzovaných erytrocytů většina proteinů. V dalším pokuse jsme navázali standard glutathionreduktázy na stacionární fázi afinitní chromatografie (2´,5´-ADP-agrarózu). Následně jsme provedli eluci GR, zachycení eluované mobilní fáze do mikrozkumavek a stanovení aktivity GR a koncentrace proteinů v eluovaném roztoku. V rámci další práce byla provedena kompletní purifikace glutathionreduktázy z odebraného vzorku krve. V tomto pokusu jsme získali glutathionreduktázu z lyzovaných lidských erytrocytů pomocí precipitace síranem amonným, dialýzy a afinitní chromatografie s výtěžkem 23 % a se stupněm očištění 4780.