Stanovení proteinových aduktů 4-hydroxyacetanilidu

Abstract

Lidský organismus během života přijde do styku s mnoha cizorodými látkami. Tyto látky jsou v organismu metabolizovány pomocí I. a II. biotransformační fáze. Paracetamol, běžně užívané antipyretikum a analgetikum, je také xenobiotickou látkou se svoji specifickou biotransformační cestou. Prvním meziproduktem po proběhnutí I. fáze biotransformace je N acetyl-p-benzochinonimin, jenž reaguje pomocí konjugační reakce s glutathionem. V případě požití nadměrného množství paracetamolu představuje tento meziprodukt příčinu vzniku hepatotoxicity, neboť dochází ke vzniku proteinových aduktů paracetamolu.

Hlavním cílem naší práce bylo optimalizovat postup přípravy pro stanovení koncentrace proteinových aduktů paracetamolu pomocí LC/MS/MS a jeho následné využití na různých druzích biologického materiálu. Během optimalizace jsme se zaměřili na jednotlivé kroky přípravy vzorku, jako jsou dialýza a proteolýza. Dobu optimálního trvání dialýzy jsme v rámci testování určili na 6 hodin s šesti výměnami dialyzačního pufru, kdy za těchto podmínek byla účinnost dialýzy 93 %. U proteolýzy jsme jako optimální dobu trvání určili inkubaci 4 hodiny, aniž by došlo ke snížení výtěžnosti stanovovaných proteinových aduktů paracetamolu. Stejně tak jsme přítomnost vápenatých iontů neprokázali jako významný faktor pro míru výtěžnosti aduktů paracetamolu.

Optimalizované postupy jsme použili při analýze vzorků biologického materiálu (jaterní tkáň myší, kultivované buňky a lidská plazma). Zde jsme se zaměřili na zjištění změny koncentrace proteinových aduktů: 1) v závislosti času a toxické dávky u myší, 2) při vzniku proteinových aduktů paracetamolu v plazmě člověka po podání terapeutické dávky, a 3) u buněk ledvin po jejich inkubaci s paracetamolem. Až na poslední případ jsme námi optimalizovanou metodou byli schopni proteinové adukty nejen detekovat, ale také kvantifikovat. S ohledem na to lze závěrem říci, že jsme zavedli a optimalizovali analytickou metodu pro stanovení proteinových aduktů paracetamolu v biologickém materiálu, která je vhodná pro charakterizaci metabolismu paracetamolu v podmínkách in vivo.