Využití fluorescenčních technik k hodnocení buněčného poškození

Abstract

Fluorescenční buněčné sondy nacházejí v dnešní době své místo především ve výzkumu, i když stále častěji se s nimi můžeme setkat i v klinické praxi. V dnešní době existuje nepřeberné množství takovýchto fluorescenčních sond. Existují sondy pro detekci mitochondriálního potenciálu, nukleových kyselin, produkce ROS atd. Cílem naší práce bylo optimalizovat použití fluorescenčních sond (JC-1, JC-10, Hoechst 33258, CM-H2DCFDA a annexinu V s propidium jodidem), porovnat sondy JC-1, JC-10 a v neposlední řadě použít fluorescenční sondy k charakterizaci modelového buněčného poškození in vitro. V naší práci jsme optimalizovali dobu loadingu sondy JC-1 na hepatomových buňkách HepG2 a buňkách lidského adenokarcinomu A549. Jako optimální jsme určili 30minutovou inkubaci. Tuto dobu loadingu jsme poté použili i u buněk renální linie HK-2. Dále jsme sledovali stabilitu sond JC-1 a JC-10 v čase, kde se ukázalo, že sonda JC-1 je poměrně stabilní oproti sondě JC-10, u níž jsme prokázali vysokou nestabilitu fluorescence. V rámci další práce jsme zavedli stanovení pomocí sond pro detekci nukleových kyselin (Hoechst 33258, propidium jodid), produkce ROS (CM-H2DCFDA) a apoptózy (annexin V) s využitím fluorescenční mikroskopie. Výše uvedené fluorescenční sondy byly použity u buněk renální linie HK-2, které byly ovlivněné acetaminofenem (0, 1 mM). Z fluorescenčních obrázků byla jasně patrná specifita každé z fluorescenčních sond. S použitím sondy Hoechst 33258 bylo zjištěno, že již při inkubaci s 1 ?M acetaminofenem dochází k fragmentaci buněčných jader a fluorescence závislá na této sondě se kumuluje na okraji buňky.