Význam inhibice reparace radiačního poškození při indukci apoptózy

Abstract

CÍL: V naší práci jsme se věnovali studiu účinku inhibitoru NU7441, který specificky inhibuje DNA-dependentní protein kinázu (DNA-PK). Zabývali jsme se jeho efektem na inhibici reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DSBs) a indukci apoptózy v kombinaci s ionizujícím zářením (IZ). Inhibitor jsme použili v koncentraci 1 mikroM a záření o dávce 1 Gy. Dále jsme provedli doplňkové experimenty k předchozí studii s inhibitorem NU7026, který méně specificky inhibuje DNA-PK a také ATM-kinázu (ATM), ovšem za použití vyšší koncentrace (10 mikroM) a pokusili jsme se srovnat účinek obou inhibitorů. MATERIÁL A METODY: Buňky T-lymfocytární leukemické buněčné linie MOLT-4 byly pro experimentální část práce rozděleny do čtyř skupin: kontrolní buňky, buňky ovlivněné inhibitorem NU7441 a v některých (doplňkových) pokusech inhibitorem NU7026, buňky ozářené dávkou 1 Gy a buňky ovlivněné kombinací obou nox. Využili jsme Western blotting a ELISA stanovení pro analýzu proteinů účastnících se reparace DNA a indukce apoptózy a epifluorescenční mikroskopii pro detekci kolokalizace proteinů gamaH2AX a 53BP1; tzv. ložiska indukovaná IZ (ionizing radiation-induced foci; IRIF). Pro zhodnocení apoptózy jsme využili průtokovou cytometrii. VÝSLEDKY: Nepozorovali jsme signifikantní změnu v množství DNA-PK podjednotek Ku70/80. Samotné ozáření vedlo k nárůstu exprese proteinu p53 a jeho fosforylací na pozicích Ser 392 a Ser 15. V důsledku toho byla zvýšena exprese proteinu p21. Pre-inkubace s NU7441 nevedla k inhibici fosforylace p53, jelikož je prováděna současně také ATM. Množství cdc25A mírně kleslo po použití kombinace nox. Inhibitor NU7026 v kombinaci s dávkou 1 Gy tlumil fosforylace některých substrátů ATM a DNA-PK, ovšem výsledná míra apoptózy byla vyšší po použití inhibitoru NU7441. Co se týče indukce apoptózy, tak kombinace IZ a NU7441 vedla ke snížení množství anti-apoptického proteinu Mcl-1 a štěpení poly (ADP-ribóza) polymerázy (PARP), což je známkou probíhající apoptózy. Množství pro-apoptického proteinu Bad kleslo mírně pouze za 72 hod po ozáření po použití kombinace. Detekovali jsme zvýšené množství apoptických buněk 24 i 72 hod po ozáření ve skupině buněk ovlivněných kombinací nox. Množství IRIF bylo také u kombinace zvýšeno. ZÁVĚR: Kombinace IZ a inhibitoru DNA-PK NU7441 způsobila zvýšení DNA poškození a následně indukci buněčné smrti. Nevedla k snížení exprese proteinu p53, jeho fosforylovaných forem nebo proteinu p21. Došlo ale ke snížení anti-apoptického Mcl-1 a byla významně indukována apoptóza 72 hod po ozáření. Protože jej lze použít v nižších koncentracích než inhibitor NU7026 a vede k intenzivnějšímu pro-apoptickému účinku, hodnotíme inhibitor NU7441 jako perspektivní platformu pro vývoj dalších účinných protinádorových léčiv.