Molekulární změny vyvolané frakcionovaným ozařováním u lidských nádorových buněk

Abstract

Cílem této práce bylo sledování molekulárních změn vyvolaných frakcionovaným ozařováním u lidských nádorových buněk. Jako modelový systém byla zvolena buněčná linie MOLT-4 odvozená od lidské T-lymfocytární leukémie. Zaměřili jsme se na srovnání změn v chování buňky po expozici jednorázové a frakcionované dávky záření. Nejprve jsme stanovili dynamiku poklesu viability buněk vlivem rozdílné expozice záření. Podrobnější analýzu indukce apopt?zy při frakcionaci dávky záření jsme zkoumali pomocí flow cytometrických metod za použití duálního značení Annexinem V a propidium jodidem a pomocí analýzy optických parametrů rozptylu světla. Prokázali jsme šetřící efekt frakcionace dávky. Následně jsme studovali změny v množství proteinů významných pro odpověď buňky na ionizující záření, tedy proteinů podílejích se na rozvoji apoptózy a na regulaci buněčného cyklu (p53 a jeho fosforylované formy, aktivovaná Chk2, ?H2A.X, Mcl-1, lamin B). Tyto změny jsme detekovali pomocí elektroforézy a western blotu s následnou imunodetekcí. Dalším krokem byla kvantifikace proteinů pomoci měření integrované optické denzity, která nám poskytla detailnější přehled o množství proteinů v jednotlivých testovaných skupinách buněk. Pro dokreslení představy o procesu v buňkách byla provedena ještě flow cytometrická analýza obsahu DNA v buňce, ve dvou intervalech po ozáření, jež nám poskytla specifičtější pohled o změnách průběhu buněčného cyklu v závislosti naprocesech probíhajících v buňce vlivem záření. Interpretace výsledků je zaměřena na identifikaci rozdílů v buňkách vystavených jednorázové a frakcionované dávce záření. Teoretická část práce charakterizuje ionizující záření a popisuje s tím související, v současné době známé molekulární mechanismy vedoucích k reparačním procesům či indukci apopt?zy na úrovni signálních cest vyvolaných aktivací ATM/ATR kinasy po poškození DNA. Popsány jsou také proteiny, které s těmito buněčnými pochody souvisí.