Spektrofotometrické a potenciometrické stanovení disociačních konstant cytostatika bosutinibu regresní analýzou

Abstract

Kombinací potenciometrické a spektrofotometrické indikace při pH-titraci multiprotického cytostatika bosutinibu u stanovení protonačních konstant byly porovnány výsledky dvou instrumentálních metod. Cytostatikum bosutinib slouží k léčbě pacientů trpících pozitivní chronickou myeloidní leukémií. Léčivo vykazuje čtyři protonovatelná místa v rozmezí pH 2-11, kde dvě z nich jsou dobře oddělené, čili vykazují log K > 3, zatímco další dvě jsou blízké disociační konstanty. V neutrálním prostředí pH 7 se vyskytuje bosutinib ve vodě v obtížně rozpustné formě LH, která se protonací převede až do rozpustného kationtu LH43+ a LH může disociovat na obtížně rozpustný anion L-. Protonace molekuly přináší dostatečnou změnu v UV spektru při nízké koncentrací 10-5 mol/l. Vějíř naměřeného spektra bosutinibu v závislosti na pH od 2 do 11 v oblasti 239.3 375.0 nm byl rozdělen na dva absorpční pásy, první v oblasti 239.3 - 290.5 nm a druhý 312.3 - 375.0 nm, které se liší citlivostí chromoforů na změnu pH. Odhady disociačních konstant z celého vějíře spektra byly porovnány s odhady z obou absorpčních pásů. Počet světlo-absorbujících částic protonačních rovnovah byl určen z hodnosti druhého momentu absorbanční matice za porovnání Kankareho-Wermontovy metody s 11 dalšími v programu INDICES. Pro omezenou rozpustnost byla protonace bosutinibu sledována ve vodně-metanolickém prostředí. I když Box et al tvrdí, že v kyselé oblasti pH 2 až 7 změna pH neovlivňuje dostatečně chromofory bosutinibu a chromofor není schopen rozlišit disociaci do dvou stupňů, ukázali jsme, že při nízkém obsahu metanolu od 3 do 6% lze spolehlivě stanovit tři disociační konstanty o odhadech pKa1 = 3,41, pKa2 = 4,69 a také pKa3 = 6,4. Byly vyčísleny koncentrační disociační konstanty nelineární regresí absorbanční matice programy SPECFIT/32 a SQUAD(84), které po extrapolaci na nulový obsah metanolu vedly k těmto hodnotám pro 25°C pKc1= 11,04(05), pKc2= 7,56(07), pKc3= 4,54(10) a pKc4= 3,43(12) a při 37°C pKc1= 10,92(06), pKc2= 7,33(05), pKc3= 5,03(08) a pKc4= 3,44(06). Distribuční diagram relativního zastoupení rozličně protonovaných částic bosutinibu v závislosti na pH titrace ukazuje, že se zvyšujícím se obsahem metanolu v rozpouštědle se potlačuje disociace a klesá procento zastoupení částice LH32+ a v roztoku převažuje částice LH. Z naměřených dat potenciometrickou pH-titrací při 25°C byly pomocí programů ESAB a HYPERQAD vyčísleny čtyři koncentrační disociační konstanty, které po extrapolaci na nulový obsah metanolu vedly k těmto hodnotám: pro ESAB pKc1= 11,05(03), pKc2= 7,97(02), pKc3= 4,37(02) a pKc4= 3,51(02), pro HYPERQUAD pKc1= 11,29(05), pKc2= 7,95(07), pKc3= 4,24(10) a pKc4= 3,29(12). Vedle odhadu disociační konstanty byly zjemňovány i specifické parametry, celková analytická koncentrace léčiva L0 a analytická koncentrace titrantu HT.