Využití vysokoúčinné kapalinové chromatografie v asistované reprodukci

Abstract

Cílem této práce bylo (a) zavést metody pro stanovení vitaminů a antioxidantů v seminální plazmě mužů a porovnat jejich hladiny mezi různými skupinami pacientů a (b) zavést metody pro stanovení aminokyselin a oxokyselin v kultivačním médiu pro porovnání metabolismu mezi jednotlivými lidskými embryi a nalézt vztah mezi metabolismem aminokyselin a morfokinetickými parametry embrya určenými time-lapse analýzou. Byly zavedeny dvě metody pro simultánní stanovení antioxidantů (vitaminů) v seminální plazmě mužů, jedna pro stanovení kyseliny askorbové a močové, druhá pro stanovení retinolu a ?-tokoferolu. V obou případech se jedná o metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí. Vzorky spermatu byly získány od mužů léčících se pro neplodnost. Při stanovení kyseliny askorbové a močové, byly ejakuláty odstředěny a seminální plazma naředěna roztokem dithiothreitolu, po filtraci byly vzorky dávkovány na analytickou kolonu s vázanou reverzní fází. Při stanovení retinolu a ?-tokoferolu byla seminální plazma deproteinována ethanolem, vitaminy byly extrahovány n-hexanem a extrakty odpařeny do sucha v atmosféře dusíku. Odparek byl rozpuštěn v ethanolu a po filtraci byl vzorek dávkován na analytickou kolonu s vázanou reverzní fází. Analytické parametry těchto metod byly vyhovující. Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v koncentracích kyseliny askorbové i močové mezi kuřáky a nekuřáky [327,4 (263,0) ?mol/l a 298,7 (146,8) ?mol/l vs. 400,0 (367,8) ?mol/l a 304,2 (138,2) ?mol/l, p > 0,05]. Podobně hladiny retinolu a ? tokoferolu se statisticky významně nelišily mezi kuřáky a nekuřáky [12 (6) nmol/l a 1,9 (0,3) ?mol/l vs. 13 (8) nmol/l a 1,8 (0,5) ?mol/l, p > 0,05]. Byly zavedeny dvě metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí, jedna pro stanovení vybraných aminokyselin, druhá pro stanovení vybraných oxokyselin v kultivačním médiu. Dvacet čtyři hodin po intraplazmatické injekci spermií, byla jedna, náhodně vybraná zygota, přemístěna do kultivačního média. Po kultivaci byla kultivační média, ve kterých se inkubovala embrya, a média, ve kterých se embrya neinkubovala (slepý vzorek), uchována při 80 °C. Vzorky médií byly derivatizovány (a) ortho-ftalaldehydem (stanovení aminokyselin) a (b) ortho fenylendiaminem (stanovení oxokyselin) za vzniku vysoce fluoreskujících derivátů. Nebyly pozorovány žádné statisticky významné rozdíly v produkci/spotřebě a obratu aminokyselin mezi dělícími se a nedělícími se embryi. Hladiny aminokyselin, které jsou součástí média, nekorelovaly s morfokinetickými znaky embrya, s výjimkou stupně fragmentace embrya ve 3. dni po oplození, kde byla pozorována negativní korelace s hladinou kyseliny glutamové a pozitivní s hladinami glutaminu, glycinu a taurinu. V médiu některých dělících se i nedělících se embryí se objevily esenciální aminokyseliny, jejichž hladiny spolu navzájem korelovaly, ale nekorelovaly s hladinami aminokyselin, které jsou součástí kultivačního média. V médiích před inkubací i po inkubaci lidských embryí byly pozorovány pouze hladiny pyruvátu a 2-oxoglutarátu.