Hmotnostně spektrometrická charakterizace sfingolipidů a glykosfingolipidů v biologických vzorcích

Show simple item record

dc.contributor.advisor Holčapek, Michal
dc.contributor.author Hájek, Roman
dc.date.accessioned 2019-11-29T08:51:35Z
dc.date.available 2019-11-29T08:51:35Z
dc.date.issued 2019
dc.date.submitted 2019-07-31
dc.identifier Univerzitní knihovna (studovna) cze
dc.identifier.uri https://hdl.handle.net/10195/74478
dc.description.abstract Tato práce se zabývá analýzou lipidů, jež mohou mít vliv na mnohdy fatální onemocnění. Lipidy jsou především důležitou součástí všech biologických tkaní s řadou důležitých funkcí v organismu. Základem lipidomických studií je identifikace a kvantifikace lipidů v biologických vzorcích. Detailní informace o celém lipidomu jsme schopni získat pomoci separačních technik ve spojení s hmotnostní. Vzhledem k velké komplexnosti lipidů je jejich identifikace a kvantifikace stále velmi náročným úkolem. První část této práce se věnuje vývoji nové metody využívající chromatografii hydrofilních interakcí (HILIC), ve spojení s hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrosprejem (ESI-MS), ke komplexní charakterizaci sfingolipidů, zejména pak gangliosidů a ostatních polárních lipidů v biologických vzorcích. Předně došlo k extrakci lipidů pomocí směsi chloroformu, metanolu a vody, kde vrchní vodná fáze obsahující gangliosidy a další polární lipidy byla přečištěna pomocí extrakce tuhou fází, kdy byla použita stacionární fáze C18. Následně byly testovány podmínky chromatografické separace za účelem dosáhnout nejlepšího rozlišeni a intenzity separovaných tříd lipidů. Pro separaci byla použita povrchově porézní kolona Ascentis Si (150 x 2.1, velikost částic 3µm). Byla testována různá koncentrace jednotlivých aditiv a pH mobilní fáze. Výsledek ukázal, že koncentrace aditiv a pH mobilní fáze nemá významný vliv pouze na separaci, ale také na intenzitu separovaných lipidů. Lipidy byly identifikovány s vysokou jistotou na základě přesné hodnoty m/z [M-H]- iontů a fragmentových iontů (MS/MS) měřených pomocí vysoko rozlišujícího hmotnostního spektrometru. Díky detailní interpretaci fragmentačních spekter bylo umožněno zobecnění fragmentačních cest, což umožnilo následné zařazení gangliosidů do série a, b či c. Strukturní přiřazení bylo dále ve shodě s předpokládaným retenčním chováním v chromatografickém modu HILIC, na základě korelace mezi retencí gangliosidů, počtem sacharidových jednotek a jejich sekvencí. Finální HILIC/ESI-MS/MS metoda byla použita pro analýzu prasečího mozku, lidských ledvin, plic, plasmy a erytrocytů. Pomocí 15 minutové LC/MS analýzy bylo identifikováno 145 jednotlivých gangliosidů z 19 třid, 71 sulfatidů a 59 polárních fosfolipidů (fosfatidylserinu, fosfatidylinositolu, lysofosfatidylinositolu a fosfatidylglycerolu). Další část této práce se zaměřuje na optimalizaci HILIC/ESI-MS metody pro kvantitativní analýzu gangliosidů (GM3) a ostatních polárních lipidů jako jsou sulfatidy, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, lysofosfatidylinositoly a fosfatidylseriny. Metoda byla validována pro kvantitativní studii lipidů v nádorové tkáni a okolní zdravé tkáni ledvin u pacientů trpících karcinomem ledvin (renal cell carcinoma, RCC). Kvantifikace probíhala na základě separace jednotlivých tříd a koeluce interního standardu náležícího pro danou třídu. Naměřená data byla semikvantitativně procesována pomocí softwaru LipidQuant a statisticky vyhodnocena pomocí vícerozměrné statistické analýzy dat (MDA), což umožnilo kompletní rozdělení obou skupin se 100 % specificitou a sensitivitou. Celkově, tak bylo identifikováno 115 jednotlivých lipidů ze sedmy tříd ve 40 vzorcích nádorové tkáně a okolní zdravé tkáně ledvin. Pro nejvýznamnější vybrané lipidy byly vytvořeny box ploty a vypočítány parametry určující významnost lipidů jako je: fold change, T hodnota a p hodnota. cze
dc.format 108 s.
dc.language.iso cze
dc.publisher Univerzita Pardubice cze
dc.rights Bez omezení
dc.subject lidomika cze
dc.subject lipidy cze
dc.subject sfingolipidy cze
dc.subject gangliosidy cze
dc.subject kapalinová chromatografie hydrofilních interakcí cze
dc.subject hmotnostní spektrometrie cze
dc.subject biologické vzorky cze
dc.subject karcinom ledvin cze
dc.subject lipidomics eng
dc.subject lipids eng
dc.subject sphingolipids eng
dc.subject gangliosides eng
dc.subject hydrophilic interaction liquid chromatography eng
dc.subject mass spectrometry eng
dc.subject biological samples eng
dc.subject renal cell carcinoma eng
dc.title Hmotnostně spektrometrická charakterizace sfingolipidů a glykosfingolipidů v biologických vzorcích cze
dc.title.alternative Mass spectrometric characterization of sphingolipids and glycosphingolipids in biological tissues eng
dc.type disertační práce cze
dc.contributor.referee Cvačka, Josef
dc.contributor.referee Hroch, Miloš
dc.contributor.referee Kuda, Ondřej
dc.date.accepted 2019-10-25
dc.description.abstract-translated Lipids are important compounds in all biological tissues having many essential functions in the organism. The identification and quantification of lipids in biological samples is a base for lipidomic studies. High-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry was used to obtain detailed information of the lipidome. Identification and quantification of lipids is still a challenging task due to their extraordinary complexity of the samples. The first part of this thesis aims to the development of a new method based on hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) coupled to a negative-ion electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) used for the identification of sphingolipids mainly gangliosides and other polar lipids in biological samples. Lipids were extracted by chloroform.methanol.water mixture, where an upper aqueous layer containing gangliosides and other polar lipid classes was further purified by solid-phase extraction using stationary phase C18. The optimization of chromatographic conditions was done with the goal to achieve the best resolution and MS sensitivity of separated lipids classes. Core.shell Ascentis Si column (150 ?  2.1, 3 ?Ęm) was tested for the separation of gangliosides. Diverse concentration of additives and pH values were used during the testing. It has been identified that additive concentration and pH values do not significantly affect separation only but also MS sensitivity. The identification of lipids was based on accurate m/z values of [M.H]. ions and fragment ions (MS/MS) measured by high-resolution MS. The detailed interpretation of MS/MS spectra enabled the generalization of fragmentation pathways, which was used for the differentiation of gangliosides a, b, and c series. The structural assignment was further in alignment with the predicted retention behavior in HILIC mode on the basis of the correlation among the ganglioside retention, the number of saccharide units and their sequences. The final HILIC/ESI-MS/MS method was applied for the analysis of porcine brain, human kidney, lungs, plasma, and erythrocytes. Resulting in identification of 145 ganglioside species from 19 classes 71 sulfatides and 59 polar phospholipids (phosphatidylserines, phosphatidylinositols, lysophosphatidylinositols, and phosphatidylglycerols) by using 15 minutes LC/MS analysis run. The next part of this thesis is focusing on optimization of the negative-ion hydrophilic liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry (HILIC/ESI-MS) method used for the quantitative analysis of ganglioside (GM3) and other polar lipid classes, such as sulfohexosylceramides (SulfoHexCer), sulfodihexosylceramides (SulfoHex2Cer), phosphatidylglycerols (PG), phosphatidylinositols (PI), lysophosphatidylinositols (LPI), and phosphatidylserines (PS). The method was fully validated for the quantitation of the studied lipids in kidney tumor and surrounding normal tissues on patients suffering by renal cell carcinoma (RCC). Quantification was based on lipid class separation and the coelution of lipid class internal standard. The raw data were semi-automatically processed using our software LipidQuant and statistically evaluated using multivariate data analysis (MDA) methods, which allowed the complete differentiation of both groups with 100% specificity and sensitivity. Overall was determinated 115 lipid species from seven classes in 40 samples of RCC tumor and surrounding normal tissues. The box plots and values highlighting statistical significance such as fold changes together with T and p values were prepared for the most significant dysregulated lipids. eng
dc.description.department Fakulta chemicko-technologická cze
dc.thesis.degree-discipline Analytická chemie cze
dc.thesis.degree-name Ph.D.
dc.thesis.degree-grantor Univerzita Pardubice. Fakulta chemicko-technologická cze
dc.identifier.signature D40170
dc.thesis.degree-program Analytická chemie cze
dc.identifier.stag 38806


This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search DSpace


Advanced Search

Browse

My Account