Biofunkcionalizace moderních materiálů pro afinitní separace a biokatalýzu

Abstract

Tato disertační práce se zabývá biofunkcionalizací vybraných moderních materiálů (nanovlákna a magnetické částice) pro účely bioafinitních separací v mikrofluidním uspořádání nebo pro podporu hojení ran nosičem s imobilizovanými proteolytickými enzymy. V první části práce je popsána biofunkcionalizace nově připravených magnetických částic proteolytickým enzymem trypsinem. Vazba trypsinu byla optimalizována a byla stanovena skladovací i operační stabilita bioaktivního nosiče. Enzym trypsin v tomto případě sloužil jako modelový biokatalyticky aktivní ligand, jehož přítomnost a aktivitu lze snadno monitorovat pomocí reakce s nízkomolekulárním chromogenním substrátem. Dále byl enzym trypsin vázán na nanovlákna připravená metodou elektrospinningu, která se po biofunkcionalizaci stala výchozím materiálem pro nový typ bioaktivního krytu ran vhodného pro proteolytické štěpení nekrotické tkáně a debridementu v ráně. Druhá část práce se zabývala povrchovou modifikací magnetických mikročástic polymerem poly(ethylenglykolem) (PEG). Tento inertní polymer zvyšuje biokompatibilitu nosiče a snižuje nespecifickou adsorpci proteinů a buněk na jeho povrch, zároveň i snižuje adhezi částic na vnitřní stěny mikrofluidních čipů. Je-li navíc použit derivát poly(ethylenglykolu) s vhodnými terminálními skupinami, je možné ho využít jako tzv. ?raménko? pro imobilizaci bioaktivních látek. Magnetické částice byly PEGylovány a poté biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM protilátkami. Tento nosič byl použit pro imunomagnetický záchyt EpCAM-pozitivních buněčných linií (modelový systém pro cirkulující nádorové buňky) v mikrofluidním uspořádání. Dosažená účinnost záchytu buněk byla porovnávána s analogickým komerčně dostupným nosičem. Poslední část práce byla směřována k vývoji specifického imunosorbentu pro mikrofluidní záchyt modelového mikroorganismu, Salmonella Typhimurium, v mléčných výrobcích. Pro přípravu nosiče byly vybrány vhodné magnetické částice i protilátky. Po vazbě protilátek byla ve vsádkovém uspořádání ověřena schopnost nosiče selektivně a účinně separovat cílové bakterie z mléka. Následně byla optimalizována technika imunomagnetického záchytu v mikrofluidním čipu ? magneticky stabilizovaném fluidním loži.